UTILIZAÇÃO DA FERRAMENTA CRISPR NA TERAPIA DE DOENÇAS AUTOIMUNES: REVISÃO DE LITERATURA

Capítulo de livro publicado no livro do I CONGEB. Para acessa-lo  clique aqui.

DOI: https://doi.org/10.53934/9786585062046-8

Este trabalho foi escrito por:

Willyane Candida Soares de Lima^*; Aline Gonçalves de Lima ; João Henrique Domingos dos Santos ; Maria Aparecida Soares Faustino; Maria Clara da Silva; Priscila Ramos da Silva; Fabiana América Silva Dantas de Souza 

*Autor correspondente (Corresponding author) – Email:

[email protected]

Resumo: As doenças autoimunes formam grupo de desordens que surgem em diversas regiões do corpo, provocando desordem no sistema imunológico e prejuízos nos mecanismos de autotolerância. O CRISPR, tem sido amplamente conhecido como editor de genoma, e é originalmente um sistema imunológico adaptativo de bactérias e archaea, podendo ser aplicado em células eucarióticas para diversos fins, incluindo terapias para doenças raras, genéticas e imunológicas. Diante do exposto, o objetivo deste trabalho foi mostrar através de uma revisão de literatura, os avanços da edição gênica com o sistema CRISPR para direcionar terapias às doenças autoimunes. No processo de edição genética com sistema CRISPR, um RNA guia é construído de acordo com os genes de interesse de um determinado DNA. O RNA conduz uma nucleasse, que pode ser a proteína Cas9, até a área que se deseja cortar, dividindo a fita dupla em duas partes, e assim iniciando o processo de reparo, e consequentemente as mudanças desejadas no DNA. Apesar das ressalvas técnicas e éticas ainda encontradas na utilização do CRISPR, em comparação com outras metodologias de edição genética, há vantagens substâncias em prol de sua utilização, tais como, sua viabilidade, facilidade de uso, confiabilidade e precisão, evidências que pressupõem um futuro importante no papel exercido pelo sistema CRISPR no combate à diversas enfermidades autoimunes.

Palavras-chave: CRISPR; doenças autoimunes; terapia gênica

INTRODUÇÃO

            As doenças autoimunes constituem grupo de desordens que surgem de um desequilíbrio no sistema imunológico e uma quebra dos mecanismos de autotolerância, que desencadeiam uma cascata de reações imunes contra os próprios tecidos do corpo. Atualmente, os tratamentos para doenças autoimunes incluem imunossupressores, modificadores da doença através de medicamentos antirreumáticos ou geneticamente modificados para terapia. No entanto, esses medicamentos estão associados a riscos de eventos adversos graves. A possibilidade de aplicação terapêutica do CRISPR-Cas9 vem surgindo com base em vários estudos que vão desde a edição de genes em embrião com variante genética da linhagem germinativa até entrega in vivo em modelos animais de doenças genéticas específicas usando vetores virais ou lipídicos (1).

O CRISPR-Cas9, tem sido amplamente conhecido tecnologicamente como editor de genoma, e é originalmente um sistema imunológico adaptativo de bactérias e archaea e pode ser aplicado em células eucarióticas com RNA guia único (sgRNA) que contém sequência de bases de um gene de interesse ao criar um sgRNA sintético de uma sequência complementar a um gene específico, Cas9, uma nucleasse de DNA guiada por RNA, pode nocautear um gene alvo. O nocaute do gene ocorre durante o reparo através da junção de extremidades não homólogas, respondendo à quebra da fita dupla. Além disso, o nocaute pode ser realizado via recombinação direta homóloga (RDH) se o DNA molde adequado estiver presente (2, 3).

Novas aplicações de nuclease tem o potencial de expandir muito nossa capacidade de manipular ácidos nucleicos, expressão, estrutura e função de proteínas. Tecnologias emergentes, como a edição de bases, ativação ou supressão via fatores de transcrição direcionados ou modificadores epigenéticos a Casa9 e edição de RNA, são novas tecnologias que podem expandir muito nossa capacidade de controlar patologias. Os vetores virais e não virais podem ser empregados para entregar efetores da edição do genoma à célula ou tecido de interesse, incluindo células T, células-tronco hematopoiéticas células-tronco pluripotentes induzidas (iPSC) e células parênquimais (4).

A terapia gênica tem sido muito promissora para tratar e prevenir doenças autoimunes. Através de muitos estudos, cientistas puderam inibir deficiências, ou até mesmo a expressão de determinados genes no tecido ou em células-alvo. Essas doenças maltratam muito as pessoas afetadas, pois atacam órgãos ou outras partes do corpo que acabam debilitando os portadores por uma falha dos mecanismos do sistema imunológico em que o próprio organismo ataca ele mesmo. Neste contexto, este trabalho teve como objetivo mostrar os avanços encontrados através da edição gênica utilizando o sistema CRISPR para direcionar terapias à doenças autoimunes.

TÓPICOS

O SISTEMA CRISPR E AS DOENÇAS AUTOIMUNES

O sistema CRISPR consiste em Sistema de Repetições Palindrômicas Curtas Agrupadas Regularmente Inter-espaçadas, geralmente com uma nuclease associada como a Cas9. O CRISPR/Cas9 e outras endonucleases estão presentes em várias aplicações envolvendo terapia gênica na modificação de genes causadores de doenças autoimunes, na triagem genômica funcional em relação a descoberta de genes ativos ou silenciados, bem como na modulação transcricional e na biologia sintética microbianas (5, 6, 4).

Nas doenças autoimunes, o organismo humano considera determinada região do corpo um agente estranho e ataca ele mesmo através do sistema imunológico, por uma falha genética do indivíduo. E para corrigir essa falha, através do sistema CRISPR juntamente com a enzima Cas9, um RNA guia junto com a enzima, são colocados dentro da célula de interesse para mudar o DNA de acordo com a característica que se quer ter como resultado após a retirado da parte defeituosa e o reparo dos nucleotídeos após a quebra da fita dupla de DNA. A alteração do DNA alvo utilizando o RNA guia com a enzima Cas9, só é possível através de vetores virais e ou nanopartículas, que irão carregar as informações necessárias para a alteração do gene de interesse (1).

            Em alguns estudos, foram identificadas citocinas pertencentes à família IL-36 que podem provocar o desenvolvimento de doenças autoimunes como o LES (Lúpus Eritematoso Sistêmico), a artrite reumatoide (AR), doença inflamatória intestinal (DII), a síndrome de Sjögren e a psoríase vulgaris (3). A proteína MYD88 que é codificada pelo gene de mesmo nome, é conhecida por ser ativada por estimulação de IL-36. A partir da inativação da proteína MYD88, por CRIPR-Cas9, houve uma diminuição na atividade dos genes e consequentemente a expressão das citocinas IL-IB e IL-36G (7). Estudos realizados a partir de uma nuclease efetora de ativação, demonstraram a correção de variantes patogênicas de TNFAIP3, fator de necrose tumoral alfa, associado a doenças autoimunes, que podem reverter as expressões relacionadas a doença autoimune (8).

CÉLULAS-TRONCO PLURIPOTENTES INDUZIDAS (iPSC) E CRISPR

Diversos meios de tratamento têm sido estudados com o CRISP-Cas9, na autoimunidade. Células Tronco Pluripotentes Induzidas (iPSCs) foram produzidas pela adição de antagonista do receptor de interleucina-1 (IL1Ra) ou gene receptor de TNF solúvel usando a edição do gene CRISPR-Cas9 e diferenciadas em cartilagem articular. Foi possível perceber que a resposta inflamatória foi atenuada ao iniciar o feedback negativo dinâmico após a estimulação com citocinas inflamatórias. Os estudos relataram que a cartilagem articular é resistente à degradação tecidual mediada por IL-1alfa pela deleção do receptor de interleucina-1 1 (IL1r1) em iPSCs de camundongos murinos (9).

A edição de genes em Células-tronco Mesenquimais (MSCs) foi usada com CRISPR-Cas9 para orientar a ativação endógena de fatores de transcrição pancreáticos e receptores de quimiocinas MSC. As MSCs foram diferenciadas em células produtoras de insulina substitutas e podem ser transplantadas por meio de expansão e transplante ex vivo, mantendo suas propriedades imunomoduladoras (10). Outros estudos ativaram com sucesso a transcrição de insulina humana endógena usando sgRNAs direcionados a múltiplos promotores de insulina e um gene de proteína 160 Cas9-virion deficiente em nuclease (dCas9-VP160) em células T de rim embrionário humano 293 T (HEK293T), Células Hela e fibroblastos humanos (8).

CRISPR E DOENÇA INFLAMATÓRIA INTESTINAL (DII)

A Doença Inflamatória Intestinal é uma doença crônica idiopática, ou seja, é de etiologia desconhecida sem causa concreta definida, que justifique o início e o desencadear da doença. Fatores ambientais, estresse oxidativo e fatores imunológicos podem estar relacionados as causas dessa doença. São exemplos dessa patologia, a colite ulcerativa e a doença de Crohn. Para terapia genética em DII foi testado estudos com modelos de células humanas e não humanas. A partir das análises dos dados, os genes JAK2, TL1A, SGK2, PTPN2, c-MYC, HDAC7, IFN-y e miR-125a foram sugeridos como candidatos apropriados para o tratamento com CRISPR Cas9 (8).

A engenharia de DNA CRISPR avançou e está evoluindo rapidamente, foi utilizado em doenças como anemia falciforme, beta-talassemia ou embriões humanos resistentes ao HIV. Dada a sua aplicação exponencial em variantes da doença, pode sugerir que é um momento ideal para aprofundar a compreensão da patogênese e tratamento da DII. Principalmente IBD refere-se a duas categorias principais de distúrbios intestinais inflamatórios crônicos recorrentes: colite ulcerativa (UC) e doença de Crohn (DC) (11).

ESTUDOS SOBRE CRISPR E DOENÇAS INFLAMATÓRIAS INTESTINAIS USANDO CÉLULAS IMUNES HUMANAS

Matthews et al. (12), investigaram SNP rs6651252 no cromossomo 8 e descobriram que o rs6651252 vive no interior de um elemento potencializador responsivo de DNA, e o elemento ligado à doença aumentam a ligação do fator de transcrição TCF7L2 à região. Então, os autores descobriram que usando o CRISPR-Cas9, o potencializador rs6651252 regula a expressão do c-MYC, e perceberam que os níveis de expressão de MYC, são elevados em pacientes portadores da doença de Crohn, uma doença gastrointestinal que afeta principalmente o intestino delgado (íleo) e o intestino grosso (cólon).

De acordo com os estudos de Li et al. (13), variantes do gene PTPN2 apareceram em pacientes portadores da doença de Crohn. O PTPN2 sofreu uma mutação com perda de função e foi correlacionado com o rs7234029 SNP. Foram utilizadas células de miofibroblastos subepiteliais (SEMF), e o resultado apontou um aumento de PTPN2 no íleo afetado, com relação ao íleo normal. No entanto, a deleção PTPN2 por meio do CRISPR-Cas9 obteve níveis mais altos de fosforilação e proliferação de STAT3 e Erk1/2. Com isso, os estudos indicaram que variantes dos genes PTPN2 e SNP rs7234029 têm fundamental importância para a doença de Crohn. Na tabela 1, observa-se alguns modelos de células humanas utilizando as ferramentas CRISPR-Cas9 em doenças autoimunes.

ESTUDOS SOBRE CRISPR E DOENÇAS INFLAMATÓRIAS INTESTINAIS USANDO CÉLULAS NÃO HUMANAS

Segundo os estudos de Pai et al. (20), sobre Fator de Necrose Tumoral (TNF), membro da família TL1A, camundongos transgênicos TL1A apresentaram Ileíte, inflamação do íleo.  Quando utilizaram o neutralizante anti-TL1A, perceberam que a concentração de endocitose bacteriana causada pelo MLCK, que estava presente na borda da escova, havia sido reduzida.  Após isso, constataram que as expressões TL1A, IFNY e MLCK1 e 2 foram reguladas na mucosa de pacientes com DII (Doença Inflamatória Intestinal). Com isso, o estudo comprovou que o aumento de TL1A, IFNy e MLCK está ligado ao curso de DII.

Eftychi et al. (21), cruzaram NEMOIEC-KO com camundongos IFNy y/y gerados pelo sistema CRISPR-Cas9, com a finalidade de verificar se IFN-y pode ter um papel importante na inflamação do Cólon. Descobriram então, que várias citocinas pró-inflamatórias, como Tnf, IL1b e IL6, apresentaram uma diminuição da expressividade nos camundongos nocauteados e apontaram o IFN-y como fator essencial para a inflamação do Cólon.

Já nos estudos de Friedrich et al. (22), foram utilizadas células colônicas epiteliais (CCE), T84 humano e CMT93 camundongos murino para identificar as funções do HDAC7. Eles também utilizaram camundongos nocauteados que foram gerados através do sistema CRISPR-Cas9, e o resultado revelou que a função das histonas de acetilase (HDAC) foi reduzida em pacientes portadores de DII. A partir dos estudos com camundongos nocaute, compreenderam que o HDAC é primordial na manutenção da barreira intestinal. Alguns modelos de células não humanas utilizando CRISPR-Cas9 em doenças autoimunes, estão representados na tabela 2.

CRISPR E LÚPUS ERITEMATOSO SISTÊMICO (LES)

Odqvist et al. (16) realizaram um teste de terapia genética em alguns modelos de células humanas com Lúpus Eritematoso Sistêmico (LES). A partir dos estudos, os genes A20 DUB e CXorf21 foram sugeridos como candidatos apropriados para o tratamento com CRISPR-Cas9, e fizeram uma avaliação se TNFAIP3 (A20) deubiquitinase (DUB) aumenta o risco de LES, para isso, usaram CRISPR-Cas9 para fazer monócitos humanos U937 com mutação knock-in C103A inativando A20 DUB. Os resultados exibiram que as células A20 C103A ou células com polimorfismo rs2230926 atraíram aumento da armadilha extracelular de neutrófilos e aumento da frequência de autoanticorpos para epítopos citrulinados. Eles também concluíram que a interrupção do domínio A20 DUB aumenta a suscetibilidade ao LES.

Harris et al. (25), focaram no envolvimento dos genes do quadro de leitura aberta 21 do cromossomo X (CXorf21) no curso da doença do LES, e conduziram experimentos de knockdown de CRISPR-Cas9 in vitro, e perceberam que o knockdown de CXorf21 resultou em uma expressão diminuída de TNF-alfa e IL-6. E assim concluíram que a expressão sexualmente dimórfica de CXorf21 poderia ser um fator de risco para LES.

CRISPR E ESCLEROSE MÚLTIPLA (EM)

Testes de terapia genética foram realizados em modelos de células humanas com EM, a partir disso, o polipeptídeo 39B da RNA helicase DEAD box, e os genes IR7R, IL2RA e TNFRSF1A, foram sugeridos como candidatos apropriados para o tratamento com CRISPR-Cas9. Os demonstraram que a via de resposta imune relacionada a IL7Rÿ é crucial na patogênese da EM. O polimorfismo de nucleotídeo único – SNP rs6897932 no exon 6 de IL7R afeta a expressão gênica da proteína solúvel versus a forma ligada à membrana e aumenta o risco de EM. A forma solúvel de IL7Rÿ é um fator de risco elevado de EM. O alelo ‘C’ de rs6897932 está associado à EM melhorando o exon 6 do gene IL7R e aumentando um silenciador de splicing de exon. A descoberta sugere que rs6897932 pode afetar a quantidade da proteína solúvel versus a forma ligada à membrana. As isoformas são importantes para regular a via de sinalização de IL7. Como resultado, tem uma relação direta entre os alelos alternativos rs6897932 e o risco de EM. (26).

Galarza-Munoz et al. (27), revelaram que a interação epistática humana é associada ao risco de EM. A RNA helicase DDX39B, um potente ativador do exon 6 de IL7R e repressor da forma solúvel de IL7R, correlaciona-se fortemente com o risco de EM, e foi demonstrado que a interação epistática entre rs2523506 em DDX39B e rs6897932 em IL7R regula o splicing do exon 6 de IL7R, e a epistasia genética e funcional com o gene IR7R tem relação com o risco de EM.

Estudos mostraram que o gene IL-2RA tem muitas variantes que aumentam o risco de EM, e várias variantes foram associadas aos níveis de sIL 2RA de forma independente. Investigaram ainda, a heterogeneidade genética de IL-2RA em EM e diabetes mellitus tipo 1 (DM1) juntos, que estão relacionados a compartilhar alelos. As variantes de IL2RA contribuíram com o risco de EM e DM1, respectivamente. E, o SNP rs2104286 localizado no íntron 1 de IL2RA foi associado à suscetibilidade da EM (28,27).

Gregory et al. (29), relataram que os agentes bloqueadores de TNF são opções de tratamento eficazes para doenças autoimunes. A investigação sugere que o SNP rs1800693 no gene TNFRSF1A, que codifica o receptor 1 do fator de necrose tumoral (TNFR1), está associado à EM como variante causal. Os agentes bloqueadores de TNF têm efeitos colaterais que promovem o aparecimento de EM e outras doenças autoimunes, como Artrite Reumatoide. No entanto, eles relataram um sinal de doença para rs1800693 preditivo de efeitos colaterais.

CRISPR E DIABETES MELLITUS TIPO 1 (DM 1)

Zhu et al. (17), realizaram dois testes, o primeiro com terapia genética em alguns modelos de células humanas com Diabetes mellitus tipo 1, já o segundo com algumas categorias de camundongos, e tomando estes estudos por base, elegeu-se como candidatos apropriados para tratamento com CRISPR-Cas9, o gene AID/RAD51 e o SNP rs10914542 do gene LCK. A pesquisa buscou designar o papel dos SNPs no gene da proteína tirosina quinase linfocitária específica (LCK), e para tal, foram adquiridas amostras de sangue de pacientes com DM tipo1 e utilizaram o CRISPR-Cas9 para conseguir o resultado da LCK SNP. Nas análises obtidas entre SNPs, apenas o SNP rs10914542 teve combinação considerável, então eles comprovaram, que o alelo G do SNP rs10914542 em LCK aumenta a ameaça de diabetes mellitus tipo 1.

Ratiu et al. (23) utilizaram camundongos nocaute do gene da Citidina Desaminasse Induzida por Ativação (AID) e encontraram uma possível forma de tratamento que é a AID\RAD51, para pacientes portadores da DM tipo 1, com o intuito de contribuir com a melhoria na qualidade de vida dos mesmos. Em outro estudo, Gerace et al., 2017, mostraram resultado na atividade da transcrição endógena da insulina humana utilizando a fusão de Ativadores Transcricionais (dCas9-VP160) e múltiplos promotores de insulina direcionados a RNAs guias simples (sgRNAs) em células HEK293T, células Hela e fibroblastos humanos. O resultado favorável desse estudo, apoia a proposta de ativação da transcrição de genes endógenos, incluídos no desenvolvimento pancreático, como Pdx-1, NeuroD1, MafA. Quando são combinados com a ativação e manutenção de genes envolvidos na imunomodulação de MSC, a probabilidade de desenvolver terapias provenientes de MSC bem sucedidas para DM1, torna-se um resultado positivo (10).

CRISPR E PSORÍASE

Segundo Arakawa et al. (18), foram realizados dois estudos; um deles buscou testar uma forma de terapia genética em células humanas na psoríase, já o segundo teste almejou analisar o mesmo em camundongos. Foram indicados como pretendentes para o tratamento com CRISPPR-Cas9, de acordo com esses estudos, os genes desmogleína 1 e ERAP1. Eles desenvolveram uma ascendência celular de melanoma nocaute ERAP1 e mostraram que a epistasia em conjunto com as variantes HLA-C*06:02 e ERAP1 afeta a psoríase. Foi observado que o gene ERAP1 tem papel essencial no progresso da psoríase, onde a orientação irá incluir a proteína 5 do tipo ADAMTS (ADAMTSL5) e a imunogenicidade dos melanócitos.

Roth-Carter et al. (24), utilizaram camundongos nocaute para desmogleína 1 e constataram que os camundongos usados no teste apresentavam um comprometimento da barreira. A análise de E18.5 da pele de camundongos knockout mostrou que o bloqueio de Dsg1 proporcionará um aumento nas vias para o processo psoriático. Os resultados compreendem um papel de Dsg1, para a separação da camada externa da célula, a epiderme onde a mesma contribui para a destinção de barreiras e normatização de respostas inflamatórias.

CRISPR E DOENÇA CELÍACA (DC)

O sistema de edição de genes CRISPR/Cas9 pode remover ou reduzir as frações tóxicas do glúten, resultando em um trigo sem glúten ou com baixo teor de glúten. O principal desafio agora é explorar totalmente a capacidade de edição do genoma do CRISPR para alterar precisamente os genes da gliadina, suprimindo sua capacidade imunogênica, mantendo sua funcionalidade e propriedades organolépticas (30).

Um estudo utilizou a terapia genética em modelos celulares no que se refere à doença celíaca, que é uma doença autoimune pela intolerância ao glúten, uma proteína encontrada no trigo, aveia, cevada, centeio e seus derivados. Os genes α-gliadina e ɣ-gliadina foram considerados apropriados para o tratamento com CRISPR-Cas9, e observaram que grãos de trigo possuem proteínas de glúten nos quais podem desencadear a doença celíaca em epítopos imunogênicos. Analisaram as sequencias dos genes α- ou γ-gliadinas, e o resultado mostrou que é possível usar o CRISPR-Cas9 para editar α- ou γ-gliadinas e fazer formas seguras de grãos (19).

CRISPR E ARTRITE REUMATÓIDE (AR)

Os pesquisadores usaram a tecnologia de edição do genoma CRISPR-Cas9 para produzir células que secretam uma droga biológica em resposta à inflamação. A droga reduz a inflamação nas articulações ligando-se à interleucina-1 (IL-1), uma substância que muitas vezes promove a inflamação na artrite ativando células inflamatórias em uma articulação. A pesquisa reprogramou os genes nas células-tronco. Em seguida, foi criado um pequeno implante de cartilagem semeando como células sob a pele de ratos. A abordagem permite uma droga seja secretada sempre que houver um surto de inflamação. Em outro estudo envolvendo os mesmos pesquisadores, a construiu foi com o estudo das chamadas células de cartilagem SMART (células-tronco modificadas para terapia regenerativa autônoma), usando tecnologia CRISPR-Cas9 para alterar genes nessas células para que, quando os genes da cartilagem fossem ativados pela inflamação, eles secretam drogas em resposta ao estimulo (31).

Em outra pesquisa, envolvendo edição de genoma de iPSCs com CRISPR-Cas9, foi criado um circuito genético sintético que detecta a alteração dos níveis de citocinas inflamatórias endógenas para desencadear uma resposta terapêutica proporcional. As células foram projetadas em construções cartilaginosas que mostraram rápida ativação e recuperação em resposta à inflamação in vitro ou in vivo. No modelo murino K/BxN de artrite inflamatória, os implantes de bioengenharia atenuaram significativamente a gravidade da doença medida pela dor nas articulações, danos estruturais e inflamação sistêmica e local. Os implantes terapêuticos evitaram completamente o aumento da sensibilidade à dor e erosões ósseas, uma façanha não alcançável pelos atuais medicamentos modificadores da doença clinicamente disponíveis (32).

CONCLUSÕES

De acordo com os resultados levantados na literatura, foi possível concluir que, a terapia gênica e especialmente o método CRISPR, tornou-se uma abordagem promissora à medida que nossa compreensão das bases imunológicas e moleculares das doenças autoimunes avançou. Apesar disso, muitos dos estudos sobre o tratamento de doenças autoimunes utilizando CRISPR, foram realizados em estudos celulares até o momento, e portanto, são necessários mais estudos em humanos. Além disso, vários desafios técnicos precisam ser abordados, como atividade fora do alvo, baixa eficiência de reparo direcionada por homologia, entrega dos componentes do sistema CRISPR in vivo, possíveis respostas imunes em decorrência de novas abordagens terapêuticas, além de aspectos éticos envolvendo manipulação genética.

Apesar dessas limitações, as evidências atuais mostram o papel promissor do CRISPR na regulação de doenças autoimunes. A crescente capacidade, viabilidade, facilidade de uso e confiabilidade dessa ferramenta, sem dúvida, levarão a novos insights fisiopatológicos e ao aperfeiçoamento de terapias em humano, que num viés ideal inibirá mais potentemente os processos inflamatórios, mas poupará o restante do sistema imunológico. No entanto, para uma substancial melhoria dessas terapias, é necessário pesquisas mais especificas para que seja possível uma entrega segura do sistema CRISPR no organismo humanos.

AGRADECIMENTOS

À Universidade de Pernambuco – Campus Mata Norte, que tem sido essencial para nossa formação; ao Laboratório de Biotecnologia da UPE – Campus Mata Norte (LABIOTEC UPE CMN), e por último, mas não menos importante, ao Grupo de Pesquisa, Extensão e Informação: ProBioTec, liderado pela Prof.ª Dr.ª Fabiana América S. D. Souza, primordial para aquisição de novos conhecimentos científicos, tornando possível o desenvolvimento deste trabalho.

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