POLIMORFISMO rs17151919 DO GENE LEP: IDENTIFICAÇÃO POR MEIO DA PCR COM INICIADORES ALELO ESPECÍFICOS

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DOI: https://doi.org/10.53934/9786585062046-7

Este trabalho foi escrito por:

Roberta Luísa Barbosa Leal ^*; Ana Beatriz Martins Topciu Fonseca ; Marcos Vinícius Guimarães Soares ; Gabriela Eduardo França de Araujo; Kênia Balbi El-Jaick

*Autor correspondente (Corresponding author) – Email: [email protected]

Resumo: A nutrigenética estuda os efeitos das variações genéticas na resposta à ingestão de alimentos, demonstrando que os nutrientes possuem efeitos diferenciados em cada indivíduo, em consequência do nosso perfil genético único. A identificação de variantes frequentes na população se torna uma estratégia interessante para uma abordagem de precisão a respeito da expressão gênica em resposta aos alimentos. O gene LEP atua em um dos sistemas neuroendócrinos mais importantes, responsáveis pelo controle do apetite, e a variante rs17151919 vem sendo associada ao fenótipo de obesidade em diversos estudos. Todavia, a falta de técnicas de custo mais baixo, alternativas ao PCR em tempo real e ao sequenciamento de DNA, para a realização dos estudos de correlação genótipo-fenótipo, ainda representa um obstáculo relevante para o desenvolvimento destas pesquisas em muitos países, incluindo o Brasil. Por este motivo, este estudo teve como objetivo desenvolver um teste de genotipagem por meio da amplificação da sequência alvo, por PCR convencional, com a utilização de iniciadores alelo-específicos para a identificação da variante rs17151919. Os resultados obtidos por meio do teste elaborado foram comparados com os obtidos por meio do sequenciamento Sanger, em amostras de DNA com genótipos conhecidos, previamente identificados por meio desta técnica. O teste de genotipagem elaborado apresentou alta sensibilidade e especificidade, sendo capaz de identificar com sucesso os genótipos homozigotos e heterozigotos, em todas as amostras de DNA analisadas e, portanto, sugere contribuir de forma expressiva para o avanço das pesquisas que visam o controle e a prevenção da obesidade na população brasileira.

Palavras–chave: obesidade; leptina; nutrição personalizada

INTRODUÇÃO

O gene LEP atua em um dos sistemas neuroendócrinos mais importantes responsáveis pelo controle do apetite, ingestão de alimentos e utilização de energia: a via leptina-melanocortina, localizada no hipotálamo (1). LEP está localizado no cromossomo 7 (lócus 7q32.1), é composto por 3 éxons e codifica uma proteína com o mesmo nome, LEP, que possui uma sequência de 167 aminoácidos. A leptina é um hormônio que medeia a regulação a longo prazo do balanço energético, suprimindo a ingestão de alimentos e estimulando a perda de peso. Mais recentemente, papéis fisiológicos importantes, além do controle do apetite e do gasto energético, foram sugeridos para a leptina, incluindo funções neuroendócrinas, reparadoras, reprodutivas e imunológicas (2). Vários efeitos sistêmicos são atribuídos à leptina, como o controle da massa corporal, o metabolismo de lipídios e glicose, termogênese, angiogênese e o controle dos sistemas hematopoiético, imune, reprodutor e cardiovascular (3; 4).

A deficiência da atividade da leptina ou do seu receptor tem sido descrita como causa monogênica para obesidade grave (5). Strobel e colaboradores (6) encontraram uma mutação com troca de sentido em homozigose (rs104894023; c.313C>T; p.Arg105Trp) em três indivíduos de uma família turca. Todos apresentavam quadro de obesidade mórbida, concentrações muito baixas de leptina sérica, hiperfagia e concentrações elevadas de insulina. Os demais familiares eram heterozigotos ou homozigotos selvagens e apresentavam os níveis de leptina e insulina normais, o que levaram os autores a determinarem que o fenótipo de obesidade expresso por esta mutação apresenta um modelo de herança recessiva. Um estudo de variantes do gene LEP, realizado com 210 indivíduos brasileiros, demonstrou que mulheres com a variante rs7799039 em homozigose (GG) possuem oito vezes mais risco de desenvolver a obesidade do que as não-portadoras, sugerindo que variantes nesse gene sejam um potencial preditor de obesidade (7).

A obesidade e a saúde metabólica prejudicada são fatores de risco já estabelecidos para as doenças não transmissíveis como diabetes tipo 2, doença cardiovascular, doenças neurodegenerativas, câncer entre outras (8).

A prevenção é uma estratégia promissora para lidar com esta doença, e pode ser alcançada através de uma melhor compreensão e controle dos fatores que levam à sua manifestação. Assim, a justificativa deste estudo consiste em padronizar um teste, com a utilização de iniciadores alelo específicos, para a identificação da variante rs17151919 do gene LEP , reconhecidamente associado à obesidade, que represente uma alternativa de menor custo de execução, e, desta forma, possa contribuir para o avanço das pesquisas na população brasileira, que visam o tratamento e a prevenção da obesidade (e comorbidades), com o auxílio de dietas personalizadas.

MATERIAL E MÉTODOS

            A sequência alvo do gene foiobtida dos bancos de dados de genes (ENSEMBL e NCBI), visando o desenho dos iniciadores para a amplificação específica dos alelos mutante e selvagem da variante LEP:rs17151919, considerando os critérios descritos por Vieceli e Siviero (9). Dois pares de iniciadores alelo-específicos (ASO) foram desenhados para a identificação da variante rs17151919 (um par de iniciadores específico para amplificação do alelo mutante e outro específico para amplificação do alelo selvagem).

Para a elaboração do teste de genotipagem, com a temperatura de hibridização mais adequada para a identificação da variante, foram realizadas reações de PCR com gradientes de temperatura a partir de 57ºC até 72ºC para os respectivos pares de iniciadores, em amostras de dois indivíduos de genótipo previamente conhecido, um homozigoto selvagem e um heterozigoto. A partir dos resultados obtidos, foi selecionada a temperatura de hibridização dos iniciadores que demonstrou ser específica para identificação dos respectivos alelos mutante e selvagem.

A PCR-ASO com gradiente de temperatura foi realizada a partir de 2 µL de amostra de DNA genômico (20-60ng) 10 µL de master mix (GoTaq G2 Hot Start Colorless Master Mix, Promega®), 1 µL de cada primer (20pmol) e 6 µL de H2O ultrapura, para o volume final de 20 µL. A amplificação foi realizada no Termociclador T100™ – Bio-Rad® nas seguintes condições: desnaturação 95⁰C por 3 minutos e 31 ciclos de amplificação (95⁰C por 1 minuto, 57°C a 67ºC por 1 minuto e 15 segundos, 72°C por 1 minuto) e extensão final a 72⁰C por 5 minutos. Nos casos em que uma temperatura mais alta que 67ºC se mostrasse necessária para confirmar a amplificação específica do alelo em questão, outra PCR com gradiente de temperatura de 65 a 72ºC foi realizada.

Após o término de cada etapa de amplificação, o produto da PCR foi submetido à eletroforese em gel de agarose 2,5%, com intercalante de DNA UniSafe Dye (20,000x; Uniscience). Um marcador de peso molecular de 100pb (Cellco) foi utilizado para a devida verificação do número de pares de bases de cada sequência alvo amplificada . As imagens foram obtidas com a utilização de um transiluminador UV.

Por fim, considerando a importância de evitar a ocorrência de resultados falso-negativos, quando houvesse ausência da amplificação alelo específica devido à falha na reação de PCR, um outro iniciador foi incluído na reação, resultando na amplificação também de uma segunda sequência alvo do gene, com um número maior de pares de bases, representando desta forma um controle positivo da reação de PCR.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Os resultados do primeiro teste realizado por meio da PCR com gradiente de temperatura, com as temperaturas de hibridização a partir de 57ºC até 67ºC, demonstraram que os iniciadores desenhados para a amplificação específica do alelo selvagem (ASO-WT) da variante LEP:rs17151919 apresentou resultados satisfatórios, ou seja, amplificação da sequência alvo de 544pb em todas as temperaturas testadas, em uma amostra conhecida com genótipo homozigoto selvagem, confirmada previamente por sequenciamento do DNA (Figura 1). 

Nota: Os resultados das PCRs ilustrados na figura revelam a especificidade do iniciador, que amplificou a sequência alvo esperada, de 544pb (para identificação do alelo selvagem da variante não sinônima rs17151919 do gene LEP), nas temperaturas de hibridização desde 57ºC até 67ºC.

Após a confirmação da amplificação satisfatória e específica da sequência alvo com o par de iniciadores desenhados para identificação do alelo selvagem, um segundo teste foi realizado para a verificação da temperatura de hibridização mínima para que a amplificação fosse realmente específica para o alelo de interesse, e a temperatura de hibridização máxima na qual a amplificação do alelo de interesse ainda fosse viável.

Assim, uma PCR com gradiente de temperaturas de hibridização mais altas (de 65,5ºC a 72,0ºC) foi feita, utilizando o iniciador ASO-WT para amplificação do alelo selvagem de LEP:rs17151919  em uma amostra heterozigota, observando-se os resultados positivos esperados até a temperatura de hibridização de 68,0ºC. Da mesma forma, outra PCR com gradiente de temperaturas mais altas (de 65,5ºC a 72,0ºC) foi feita, utilizando o par de iniciadores específico para amplificação do alelo mutante (ASO-MUT) em uma amostra homozigota selvagem. Considerando a ausência do alelo mutante na amostra homozigota selvagem, e a amplificação específica do alelo mutante pelo iniciador ASO-MUT, era esperado que não ocorresse a amplificação da sequência alvo na amostra testada. Os resultados do teste revelaram satisfatoriamente a ausência de amplificação inespecífica do alelo selvagem com a utilização do iniciador ASO-MUT, confirmando os resultados negativos que eram esperados.

Em resumo, os resultados obtidos a partir das duas PCRs com gradiente de temperatura mostraram que: a) a PCR com o par de iniciadores ASO-MUT desenhados, revelou resultados satisfatoriamente específicos para a amplificação do alelo mutante com a temperatura de hibridização a partir de 65,5ºC; b) a PCR com iniciadores ASO-WT, revelou resultados satisfatórios para a amplificação do alelo selvagem com temperaturas de hibridização até 68ºC para LEP:rs17151919.

Assim, na etapa seguinte, buscou-se determinar a temperatura de hibridização mínima para que a amplificação do alelo variante (com iniciador ASO-MUT) fosse realmente específica para este alelo, ou seja, quando uma amostra que não possui o alelo variante apresente resultados claramente negativos (refletindo a especificidade do teste), e uma amostra que apresente o alelo variante apresente resultados claramente positivos (refletindo a sensibilidade do teste).

Com esta finalidade, uma PCR com gradiente de temperatura foi realizada utilizando o iniciador ASO-MUT para amplificação dos alelos mutantes de LEP:rs17151919 em uma amostra heterozigota, observando-se os resultados positivos esperados em todas as temperaturas de hibridização testadas, desde 57,0ºC até  67ºC. Além desta, outra PCR com gradiente de temperatura foi também realizada utilizando o iniciador ASO-MUT visando a amplificação do alelo mutante de LEP:rs17151919 em uma amostra homozigota selvagem (que não possui alelos mutantes). A PCR teste revelou resultados inespecíficos (amplificação de alelos selvagens) até a temperatura de hibridização 60,8ºC, e resultados satisfatórios para a amplificação específica do alelo mutante a partir de  63,1ºC, quando a PCR realizada com a amostra homozigota selvagem, que não contém alelos mutantes, não revelou mais qualquer amplificação (Figura 2).

A partir deste terceiro teste foi possível verificar a alta especificidade do par de iniciadores específicos para identificação do alelo mutante de LEP:17151919 a partir da temperatura de hibridização de 63,1ºC.

Entretanto, apesar dos resultados promissores referentes à especificidade do teste de genotipagem, a ocorrência de resultados falso-negativos devido a uma possível falha na reação de PCR, representava ainda um problema que poderia resultar em diminuição da sensibilidade do teste. Por isso, um outro iniciador foi incluído na reação, resultando na amplificação de uma segunda sequência alvo do gene, com um número maior de pares de bases, a fim de representar um controle positivo da reação de PCR. Assim, um novo teste foi realizado em amostras homozigotas selvagens e heterozigotas para testar a amplificação de uma ou das duas sequências alvo: a sequência indicadora da presença do alelo mutante de LEP:17151919 (que poderia ser positiva ou negativa), e uma sequência de 855pb que representaria o controle positivo da reação de PCR (que deveria ser sempre positiva, em todas as amostras, confirmando que a reação de PCR funcionou).

A amplificação dos fragmentos de interesse por meio da técnica de PCR-ASO foi alcançada, mostrando resultados satisfatórios para a identificação de ambos os alelos, mutante e selvagem, da variante LEP:rs17151919 (c.280G>A; p.V94M).

Após a etapa de padronização, o teste elaborado foi realizado em 70 amostras de DNA, com genótipos previamente conhecidos, obtidos por meio do sequenciamento Sanger (dados de outros estudos, realizados anteriormente). A análise da sensibilidade e especificidade do teste de genotipagem foi realizada por Razão de Verossimilhança, a partir da comparação entre os resultados obtidos por meio da PCR-ASO e os dados obtidos por meio do sequenciamento do DNA.

As análises revelaram que os mesmos resultados obtidos por meio do sequenciamento do DNA foram obtidos por meio da PCR ASO-MUT, em todas as amostras testadas, confirmando a alta sensibilidade e especificidade do teste, como o visualizado na Figura 3.

Concluída a confirmação dos resultados da amplificação dos fragmentos de interesse por meio da técnica de PCR-ASO, mostrando resultados sensíveis e específicos para a identificação do alelo mutante da variante LEP:rs17151919 (c.280G>A; p.V94M), o teste da PCR ASO-WT (com iniciadores específicos para os alelos de referência) foi realizado nas amostras com resultados positivos para o alelo mutante, a fim de identificar se os genótipos eram heterozigotos ou homozigotos para o alelo mutante.

Os resultados da amplificação por meio da PCR ASO-WT, para identificação do alelo selvagem de LEP:17151919, foram visualizados em gel de agarose 2,5%, em transiluminador UV, e interpretados por pelo menos dois pesquisadores, revelando, da mesma forma que a PCR ASO-MUT, concordância em 100% dos casos com os resultados obtidos por meio do sequenciamento do DNA, confirmando a alta sensibilidade e especificidade do teste (Figura 4), e revelando que todas as amostras positivas para o alelo mutante de LEP:rs17151919, eram também positivas para o alelo selvagem, concordando com os resultados do sequenciamento de DNA previamente realizados, que mostraram que todas as amostras testadas possuem genótipo heterozigoto.

CONCLUSÕES

Esses resultados demonstram que o teste genético elaborado a partir do desenho de iniciadores alelo específicos para a identificação da variante rs17151919do gene LEP é capaz de identificar os genótipos dos indivíduos com precisão, de maneira rápida e com custo mais baixo, quando comparados ao diagnóstico molecular realizado por meio da PCR em tempo real e do sequenciamento do DNA, os quais necessitam de kits comerciais e equipamentos de custo mais alto para sua execução, além de recursos humanos especializados.

A possibilidade de diagnóstico precoce da pré-disposição a doenças tão frequentes na população, como a obesidade e a diabetes do tipo 2, é certamente uma importante contribuição para a o desenvolvimento de estratégias de prevenção. Neste contexto, é importante ressaltar os benefícios do incentivo ao uso de técnicas de biologia molecular convencionais, como a PCR, principalmente pela robustez e praticidade desta técnica, que pode ser executada na grande maioria dos laboratórios que realizam experimentos de biologia molecular em todo o mundo. Por esse motivo, sugerimos neste estudo o incentivo à utilização de ensaios multiplex iniciadores alelo específicos, os quais podem ser desenvolvidos e adaptados para serem testes mais acessíveis e rápidos, e serem realizados ​​em laboratórios com termocicladores convencionais e menos recursos, permitindo o diagnóstico rápido e específico de possíveis fatores de risco genéticos para a obesidade, e contribuindo para o avanço dos estudos em nutrigenética e de intervenções dietéticas personalizadas, auxiliando na prevenção de doenças e na promoção da saúde.

AGRADECIMENTOS

O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior – Brasil (CAPES) – Código de Financiamento 001 e do Programa Institucional de Bolsas de Iniciação Científica (PIBIC/CNPq). Agradecemos o suporte da Universidade Federal do Estado do Rio de Janeiro (UNIRIO) e do Programa de Pós-graduação em Biologia Molecular e Celular (PPGBMC/UNIRIO), e o auxílio das agências de fomento: Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) e Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ).

REFERÊNCIAS

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