APLICAÇÃO DA TECNOLOGIA CRISPR NA PREVENÇÃO, DETECÇÃO E TRATAMENTO DA COVID-19: REVISÃO DE LITERATURA

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DOI: https://doi.org/10.53934/9786585062046-11

Este trabalho foi escrito por:

Elym Vitoria Araújo da Silva^*; Alison Guilherme da Silva ; Nicole Régia de Lima Lins ; Silvânia Cabral de Oliveira ; Fabiana América Silva Dantas de Souza  

*Autor correspondente (Corresponding author) – Email: [email protected]

Resumo: A COVID-19, doença causada pelo vírus SARS-CoV-2, tem causado um alerta aos pesquisadores de todo do mundo por oferecer riscos para a saúde pública, se espalhar rapidamente, e ser causadora da síndrome respiratória aguda grave (SRAG). Devido sua rápida disseminação, foi necessário a busca por meios rápidos e eficientes para a prevenção, por meio de produção de vacinas e medicamentos antivirais eficazes, bem como a detecção e tratamento dessa patologia. A técnica CRISPR é uma inovação tecnológica, a qual já tem sido utilizada para o controle de outras doenças, e tem se tornado também uma forte aliada aplicada no combate ao novo coronavírus. Pois essa ferramenta, possibilita a identificação e a edição genética viral de forma eficaz, possibilitando uma conclusão de forma mais rápida, simples de ser utilizada, e de baixo custo, se comparada a outras técnicas tradicionais. Nesse estudo de revisão, discorreremos sobre a aplicação da ferramenta CRISPR perante a infecção ocasionada pelo SARS-CoV -2, bem como suas limitações e perspectivas futuras.                                                                

Palavras–chave: COVID-19; CRISPR; edição genética; SARS-CoV-2

INTRODUÇÃO

Nos últimos anos, o mundo vem enfrentando uma crise na saúde pública com a chegada do novo coronavírus, que surgiu desde o final do ano de 2019, e causou a COVID-19 (Doença do Coronavírus), acarretando diversos impactos em muitos países (1). Com o surgimento do SARS-CoV-2 (Coronavírus 2 da Sindrome respiratória aguda grave), um quadro pandêmico se estabeleceu, um alerta foi emitido pela Organização Mundial da Saúde – OMS, à sociedade, o que se exigiu medidas importantes e urgentes em busca do controle da circulação do vírus entre a população, e fazendo-se preciso a busca de meios eficazes para detecção, prevenção e tratamento da doença (2,3).

Diante do cenário pandêmico, se fez de suma importância a ampliação de estudos referentes ao fortalecimento da capacidade de detecção de patógeno, visando à aceleração do desenvolvimento de vacinas e medicamentos antivirais específicos. Perante os desafios durante as etapas de avaliação dos testes clínicos, a ciência buscou soluções eficientes, visando desenvolver e testar intervenções antivirais para controlar a COVID-19 em humanos, e outras diversas variantes que poderiam vir a surgir (4).

Perante estes desafios, os cientistas vêm aprimorando técnicas biotecnológicas já existentes, baseada especificamente na CRISPR/Cas, (a sigla é referente a um Conjunto de Repetições Palindrômicas Curtas e Regulamente Espaçadas, com a ação de proteínas associadas), para a detecção, prevenção e tratamento da doença causada pelo SARS-CoV-2. Essa técnica tem demostrado eficácia até o dado momento, mostrando-se como um avanço na ciência, pois o desenvolvimento e a aplicação deste sistema têm apresentado realizações notáveis na edição de genes, triagem de genes funcionais, dentre outros (5).

No processo de compreensão do desenvolvimento e fortalecimento de estratégias competentes a serem utilizadas no combate a infecções com potenciais pandêmicos, este trabalho teve como objetivo realizar uma revisão de literatura acerca da utilização da ferramenta CRISPR/Cas no controle, prevenção, detecção e tratamento da COVID-19.

APLICAÇÃO DA TECNOLOGIA CRISPR/CAS EM SARS-COV-2

A CRISPR/Cas é uma técnica de defesa utilizada naturalmente por bactérias e arqueas contra vírus bacteriófagos e plasmídeos que as invadem. Basicamente os DNAs invasores são clivados pelas enzimas Cas, uma porção clivada é então colocada entres sequências CRISPR, as quais são usadas como referência para gerar sequências curtas de RNA (6,7). As sequências direcionam a proteína Cas ao DNA invasor, que será clivado e inativado (8).                                                                                           

Desde o início da pandemia da COVID-19, muitos cientistas voltaram seus esforços para o desenvolvimento de estratégias com CRISPR/Cas para combater o vírus SARS-CoV-2, uma vez que essa técnica demonstra ser uma excelente aliada aos métodos já utilizados no controle de doenças infecciosas (9). Assim, ela pode ser aplicada na prevenção, através do desenvolvimento de vacinas, detecção, bem como na terapia da doença causada pelo novo coronavírus, devido suas diversas possibilidades de uso, a técnica tem mostrado grandes avanços nas pesquisas envolvendo a COVID-19, além de apresentar baixo custo, e pouca exigência tecnológica para sua aplicação (10).

APLICAÇÃO DE CRISPR NA DETECÇÃO DE SARS-COV-2

O vírus SARS-CoV-2 tem causado desequilíbrio na saúde em grande parte da população mundial. As manifestações clínicas são bastantes semelhantes a outras doenças que afetam o sistema respiratório, como, por exemplo, a gripe. Dessa forma, é importante um diagnóstico preciso e rápido para que o tratamento adequado seja prescrito. A técnica mais utilizada para detecção do vírus, considerada “padrão-ouro”, é a RT-qPCR (Reação em Cadeia da Polimerase em Tempo Real), no entanto, ainda há limitações nessa técnica, como a complexidade e seu elevado valor (11). Assim, são de grande valia novas técnicas que necessitem de menos recursos e apresentem metodologias rápidas e precisas.      

Nesse contexto, a técnica CRISPR/Cas tem sido usada para detecção rápida do agente etiológico do SARS-CoV-2, ajudando no combate contra a disseminação do vírus (12). Segundo Zhou et al., (13), se comparada às técnicas tradicionais, a técnica CRISPR/Cas é superior no que se refere a velocidade de detecção, custos, facilidade de uso, sensibilidade e especificidade, o que torna essa ferramenta ainda mais cobiçada para utilização em diversas etapas para o diagnóstico e intervenção de uma doença.

Para fazer a detecção do agente causador da COVID-19, são necessários dois personagens principais: a endonuclease Cas, que quebra o local genômico alvo; e o gRNA, que identifica e direciona a endonuclease. O processo se dá com o corte na região alvo pelo crRNA e as proteínas CRISPR, seguida da complementação dessa região específica com a sequência de crRNA.  As proteínas CRISPR são as Cas9, Cas12, Cas13, dessas, as duas últimas são excelentes em clivagem lateral (diferente da Cas9), permitindo a clivagem indiscriminada do ácido nucleico periférico, estando elas ligadas ao alvo (14).

Em um ensaio realizado por Broughton et al., (15), foi feita a transcrição reversa síncrona mais amplificação isotérmica, mediada por loop (RT-LAMP), para material genético retirado de swabs nasofaríngeos ou orofaríngeos em transporte universal, e com seguida detecção de sequências do vírus definidas anteriormente pela proteína Cas12. Depois da clivagem de uma molécula repórter, a constatação do SARS-CoV-2 foi confirmada. Em outro estudo, foram utilizados sinais de fluorescência para detecção do vírus. Nesse método, o gene repórter, que foi clivado pela proteína Cas12a, foi marcado com uma molécula fluorescente, e caso houvesse material genético do SARS-CoV-2, a fluorescência poderia ser vista sob luz à 48 nm (16). Além dos citados, vários outros ensaios foram realizados para detecção do vírus, informações acerca de alguns deles podem ser observadas na tabela 1.

Tabela 1, Estudos de diagnóstico SARS-CoV-2 baseados em CRISPR

CRISPR/Sistema	Plataforma	Tempo de ensaio	Especificidade/Sensibilidade	Referência
CRISPR–Cas13a	SHERLOCK	>60 min	100%/96%	Patchsung et al., (17)
CRISPR–Cas13a	CREST	110 min	100%/88.8%	Rauch et al., (18)
CRISPR–Cas13a	SHINE	50 min	100%/90%	Arizti-Sanz et al., (19)
CRISPR–Cas13a	CRISPR-COVID	40 min	100%/100%	Hou et al., (20)
CRISPR–Cas12b	STOPCovid	<60 min	98.5%/93.1%	Joung et al., (21)
CRISPR-Cas12a	SENA	60 min	100%/100%	Huang et al., (22)
CRISPR–Cas9	TL-LFA	< 60 min	97.1% /100%	Xiong et al., (23)
CRISPR–Cas12a	CRISPR-FDS	15 min	100%/ 100%	Ning et al., (24)
CRISPR–Cas12a	CRISPR-ABC	30-40 min	91.2%/ 99.2%	Huang et al., (22)

VANTAGENS DO CRISPR NA DETECÇÃO DE SARS-COV-2

Devido à sua excepcional sensibilidade, especificidade e confiabilidade, detecção de ácido nucleico direcionada por RNA baseado na nuclease CRISPR/Cas mostrou recentemente potencial para o desenvolvimento de diagnóstico molecular de novo poder tecnológico (25,26). A utilização da CRISPR oferece vantagens em relação as técnicas existentes para detecções de patógenos, dentre as vantagens, é possível destacar a amplificação de sinal isotérmico para detecção rápida de alvos na ausência de um termociclador, além de ser um método acessível e imediato em comparação ao RT- qPCR, pois o sistema CRISPR não requer muita instrumentação ou processos complicados para execução da técnica (14).

A técnica CRISPR é bem mais rápida em comparação a técnica RT-qPCR, pois enquanto a proteína CRISPR leva menos de 40 minutos para a identificação do vírus causador da COVID-19, a outra citada, leva muito mais que isso, correspondendo ao resultado de 24 horas (20). Logo, é válido ressaltar também que os outros métodos requerem combinações específicas de ácidos nucleicos com procedimentos manuais, o que acarretará complicações no procedimento e provoca danos ao meio ambiente (9).

MÉTODOS BASEADOS EM CRISPR/CAS PARA TERAPIA COVID-19

A utilização de terapia convencional para patologias virais inicia com a prevenção da   infecção e sua proliferação. Como os vírus se espalham rapidamente, são utilizados medicamentos já existentes para um tratamento mais rápido. As drogas candidatas, para o tratamento da doença causada pelo vírus SARS-CoV-2, a COVID-19, geralmente tem a finalidade de interromper a função enzimática do vírus, prevenir a ação de endocitose viral, bloquear proteínas virais e consequentemente, auxiliar a imunidade inata e/ou diminuir a resposta inflamatória e replicação do vírus (5).

 Contudo, o vírus SARS-CoV-2, sofre mutações rapidamente, o que muitas vezes torna o medicamento ou a vacina ineficaz. Por isso, é necessário novas terapias que se baseiam no direcionamento sequencial do genoma viral, como a ferramenta biotecnológica CRISPR/Cas, que possibilita a identificação do material genético do vírus sendo o DNA ou RNA, e viabilizando seu corte e sua inativação (27). O CRISPR antiviral profilático (PAC-MAN) em células humanas, consegue encontrar e destruir a sequência viral e suas mutações presentes nas células epiteliais do pulmão do ser humano, possibilitando o reconhecimento de mais de 90% dos coronavírus (28).                                     Outra estratégia viável é a utilização da nuclease de RNA CRISPR-Cas13, que é guiada por RNA de classe 2 do tipo VI, e consegue suprimir com eficácia a expressão gênica inibindo a infecção por coronavírus pós-transcricional. Além disso é uma ferramenta segura, e fácil de usar porque funciona ao nível do RNA (29). Outro estudo teve como objetivo usar a capacidade do sistema CRISPR-Cas13a de editar RNA com a vantagem de combater o SARS-CoV-2. A Cas13a funciona quando ativado por um crRNA particular que visa em uma sequência específica de RNA de fita simples para clivar o RNA alvo e causar clivagem colateral, resultando na clivagem da sequência de RNA SARS-CoV-2, impedindo assim a síntese de proteínas virais e a replicação viral (30).

Nguyen et al. (31), utilizaram o sistema CRISPR-Cas13d com três RNAs guia para direcionar vários peptídeos de regiões codificadas do material genético do RNA SARS-CoV-2, que foram empacotadas em um vetor de vírus adeno-associado (VAA), a fim de reduzir a chance de resistência. O vírus adeno-associado possui sorotipos altamente específicos para o pulmão, que é um dos principais órgãos que pode ser infectado pelo SARS-CoV-2.

Semelhante a terapia genética, a terapia celular é uma das mais novas intervenção terapêutica na era CRISPR. A terapia celular é considerada uma forte alternativa para o tratamento da COVID-19, pois os primeiros resultados foram favoráveis e apresentaram melhoras significativas para a saúde, além de também ter apresentado resultados positivos para a infecção por H5N1, vírus da influenza A aviária (32). A utilização de modelos animais contribuirá para simulações in vivo e consequentemente, contribuirá para a eficiência das ferramentas baseadas em CRISPR utilizadas para antivirais (33).

APLICAÇÃO DE SISTEMAS CRISPR/CAS NO DESENVOLVIMENTO DE VACINAS E DROGAS

Mediante os estudos realizados, entende-se que os medicamentos antivirais, nem sempre se apresentam de modo eficaz perante doenças infecciosas emergentes. Diante disso, com o surgimento de novas tecnologias, como a CRISPR/Cas, é possível encontrar resultados com mais rapidez e facilidade, causando inibição de replicação viral (34,35). Sun et al. (36), geraram ratos modelos que expressaram a enzima conversora de angiotensina II humana (hACE2) usando a técnica de nocaute Cas9, que foi utilizada para estudar a transmissão e patogênese do SARS-CoV-2 e fornecer uma ferramenta útil para avaliar as vacinas para COVID-19 e drogas terapêuticas.

A vacinação é a intervenções mais econômica de saúde pública para a prevenção e controle de doenças infecciosas, e uma das formas mais eficazes de prevenir a propagação em larga escala de doenças infecciosas. No entanto, o desenvolvimento de uma vacina geralmente é um processo complexo que requer tempo e dinheiro. O desenvolvimento de vacinas específicas de forma rápida e fácil sempre foi uma preocupação para cientistas, e em resposta a doenças infecciosas emergentes, a CRISPR/Cas9 é uma técnica potencial para impulsionar o progresso no desenvolvimento de vacinas (37).

Desta forma, com o desenvolvimento assistido de medicamentos e triagem alvo, obtêm-se uma facilidade para a geração de alterações nos genomas, tornando-se assim, uma ferramenta facilitadora para a descoberta de vacinas e drogas, permitindo a prevenção de doenças infecciosas existentes e que ainda podem vir a surgir (1).

LIMITAÇÃO DA TECNOLOGIA CRISPR

A técnica CRISPR/Cas tem avançado cada vez mais e sua utilização tem se espalhado entre pesquisadores e profissionais da área saúde. E, apesar de ser muito atraente, esse novo método possui limitações. Uma dessas limitações é dificuldade de identificação da região pela Cas9 no momento da edição genética do indivíduo, o que possibilita uma alteração acidental, podendo resultar em uma patologia como o câncer (1).

Outra limitação importante em se tratando do vírus, é a atividade fora do alvo, podendo gerar mutações virais, o que também é um problema, pois se houverem células infectadas, o tratamento pode se tornar ineficaz. Além disso, o corpo pode possuir imunidade ao sgRNA, assim como a proteína Cas, impedindo a participação apropriada da ferramenta CRISPR/Cas (9,38).

Além do mais, a ferramenta CRISPR desperta preocupações éticas e de segurança acerca de sua prática, levantando discursões sobre até onde ela pode ser permitida, e, como e quando deve ser utilizada. Diante deste contexto, sua aplicação, ainda deve envolver muitos estudos, experimentos e ensaios clínicos para que os riscos sejam amenizados e a ética não seja prejudicada (39).

PERSPECTIVAS FUTURAS

A tecnologia CRISPR promete desempenhar um papel fundamental acerca dos desafios envolvendo novos possíveis cenários pandêmicos. Para tal, é importante esforços e estudos constantes para superar preocupações que envolvem sua eficiência terapêutica, pois essa ferramenta avançada pode evitar reinfecções, imunidade de curto prazo ou resistências virais em comparação a muitos medicamentos e vacinas tradicionais (40).

A tecnologia CRISPR/Cas pode ser utilizada para refinar os coquetéis combinados de células CAR-T, células CAR-NK e anticorpos neutralizantes contra SARS-CoV-2. Além disso, a tecnologia CRISPR/Cas é proposta em hipóteses para degradar o RNA viral para encerrar as atividades do SARS-CoV-2. Assim, coquetéis personalizados de imunoterápicos e os sistemas CRISPR Cas contra o COVID-19 como estratégia podem ser uma opção para inibir a progressão da doença e contornar a fuga de imunidade levando em consideração os fatores genéticos. A ferramenta CRISPR/Cas ainda requer muita pesquisa antes que possa ser aplicada clinicamente e com segurança para quebrar o genoma do SARS-CoV-2 in vivo com alta eficácia, no entanto, os desafios precisam ser superados para descobrir um sistema de entrega adequado, além de existir questões morais a serem consideradas antes da aplicação clínica (41).

CONCLUSÕES

Tendo como base as literaturas revisadas, é possível considerar a técnica CRISPR como uma excelente oportunidade de avanço para as diversas áreas da ciência.  No caso do SARS-CoV-2, a técnica demonstrou melhor eficiência quando comparada a técnicas já utilizadas. Ela tem potencial para ser utilizada em terapias, para detecção, e prevenção da doença causada pelo coronavírus. Por outro lado, ainda há limitações que precisam ser superadas, limitações essas, que podem ser suprimidas através de novos estudos e pesquisas.                                                                                                                          A identificação da patologia mediante a técnica CRISPR talvez seja o avanço mais importante para a COVID-19, uma vez que a rápida detecção da doença é essencial para o controle da mesma. A CRISPR possibilita uma detecção rápida, com alto nível de sensibilidade, e com baixo custo, tornando-a indispensável para aplicação em doenças com características semelhantes a COVID-19. Além da detecção, o uso em terapias e produção de vacinas também se mostraram muito promissoras.    

AGRADECIMENTOS

À Universidade de Pernambuco – Campus Mata Norte, que tem sido essencial para nossa formação; ao Laboratório de Biotecnologia da UPE – Campus Mata Norte (LABIOTEC UPE CMN), e por último, mas não menos importante, ao Grupo de Pesquisa, Extensão e Informação: ProBioTec, liderado pela Prof.ª Dr.ª Fabiana América S. D. Souza, primordial para aquisição de novos conhecimentos científicos, tornando possível o desenvolvimento deste trabalho.

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