Capítulo de livro publicado no Livro da IV Mostra dos Trabalhos de Conclusão de Curso da Especialização em Vigilância Laboratorial em Saúde Pública. Para acessa-lo clique aqui.

doi.org/10.53934/9786599965821-29

Este trabalho foi escrito por:

Rebeca Castro Malfatti Barbosa de Oliveira¹ Andréia Moreira dos Santos Carmo²

¹Estudante do Curso de Pós Graduação lato sensu em Vigilância Laboratorial em Saúde Pública – Vigilância Epidemiológica – CRL IAL de Santo André; e-mail: [email protected]

²Docente e Pesquisadora do Núcleo de Ciências Biomédicas – CRL IAL de Santo André

Resumo:

A Organização Mundial da Saúde decretou pandemia da COVID-19 em 11 de março de 2020. A partir deste momento, foi recomendado o diagnóstico molecular por RT-qPCR para detecção de segmentos alvos do genoma viral que codificam regiões conservadas nos coronavírus e específicas para o SARS-CoV-2, a partir de amostras de swab naso/orofaríngeo. O objetivo deste estudo é avaliar a concordância entre os resultados de detecção do SARS-CoV-2 na rotina diagnóstica e o teste XpertXpress® SARS-CoV-2 em amostras de gargarejo com solução fisiológica e avaliar a possibilidade de amplificação direta do RNA viral, sem a etapa de extração, para então apresentar uma proposta de liberação rápida dos resultados com a utilização de amostras mais simples de serem obtidas e com menor risco biológico aos profissionais envolvidos.

O estudo ocorreu no Centro de Laboratório Regional de Santo André do Instituto Adolfo Lutz, utilizando 69 amostras de gargarejo com soro fisiológico 0,9% estéril, para detecção direta, destas, 58 amostras foram utilizadas para a metodologia utilizando o sistema do GeneXpert, armazenadas sob congelamento e provenientes da testagem de profissionais de saúde do laboratório e do GVE VII, testamos tais métodos e os resultados foram comparados aos da metodologia padrão ouro.

Foi possivel perceber que a maioria dos resultados obtidos na detecção direta (sem extração de RNA) dos genes E e N de SARS-CoV-2 em gargarejo corresponderam ao resultados esperados (com extração). E os resultados obtidos no sistema GeneXpert obtiveram correlação positiva ao comparar ao padrão ouro, superior até, a metodologia sem extração. O tempo de liberação dos resultados no sistema GeneXpert foi 2,3 vezes menor que o RT-qPCR utilizado na rotina diagnóstica da COVID-19, com liberação de 4 testes a cada 50 minutos. A proposta de utilização do gargarejo pode ampliar o portifólio de amostras a serem utilizadas no teste Xpert Xpress® SARS-CoV-2. Concluímos que amostras de gargarejo podem ser utilizadas como amostras alternativas à secreção nasofaríngea utilizando o teste XpertXpress® SARS-CoV-2.

Palavras–chave: SARS-CoV-2, Coronavírus, Diagnóstico Laboratorial, RT-PCR, Biologia Molecular

INTRODUÇÃO

O vírus SARS-CoV-2 é o nome do agente causador doença nomeada COVID-19. Este nome é derivado de Coronavírus disease a Doença do Coronavírus e “19” referente ao ano de surgimento dos primeiros casos na China, especificamente em Wuhan, divulgado ao final do mês de dezembro de 2019. Posteriormente, ao se espalhar para outros continentes, foi decretado pela Organização Mundial da Saúde (OMS) em 11 de março de 2020, oficialmente como pandemia. É um vírus do tipo RNA, de fita simples com cerca de 30.000 bases, de polaridade positiva, envelopado, esférico e com espículas em sua superfície. Pertence a família Coronaviridae , conhecida desde 1960 (MALFATTI, 2020). O envelope do SARS-CoV-2 consiste em uma camada bilipídica onde estão ancoradas as proteínas estruturais de envelope (E), membrana (M), e as espículas (S, spikes), além de uma proteína menor de superfície chamada hemaglutinina esterase (HE). A glicoproteína S é composta por duas subunidades funcionais S1 e S2, sendo a S1 responsável pela ligação do vírus às células do hospedeiro através de uma região denominada receptor-binding domain (RBD) que se liga ao receptor angiotensin-converting enzyme 1 (ACE-1), e a S2, pela fusão, e no interior do vírus há um nucleocapsídeo (N) que protege o RNA genômico (SBAC, 2022). O SARS-CoV-2 apresenta mutações genéticas diversas, alterando a sua virulência em hospedeiros humanos (MALFATTI, 2020).

MATERIAL E MÉTODOS

O estudo foi realizado com 69 amostras de gargarejo de profissionais sintomáticos do CLR IAL de Santo André VIII e GVE VII. O diagnóstico primeiramente foi realizado pelo método padrão ouro, extração foi realizada pela plataforma automatizada Maelstrom™ 9600 (TANbead e pra à amplificação foi utilizado o kit Allplex^TM SARS-CoV-2 Assay e qPCR QuantStudio 5 (Thermo Fisher Scientific).

Na primeira metodologia aqui apresentada, estas amostras foram retestadas sem a etapa de extração. Neste caso, estas foram descongeladas a temperatura ambiente por 10 minutos, 30 µL de cada amostra foi adicionada à microtubos livres de nucleasse, incubados a 95°C por 30 min e posteriromente submetidos a concentração por centrifugação á 8000 rpm por 1 min em centrífuga de microtubos, 10 µL da amostra foi utilizado para o ensaio de qPCR.

Para a realização da segunda metodologia aqui apresentada, o teste XpertXpress® SARS- CoV-2, pela plataforma Genexpert (Cepheid), as amostras não passaram por nenhum preparo prévio, a não ser o descongelamento. A amostra foi cuidadosamente homegeneizada, evitando-se a formação de bolhas e, após a abertura da tampa do cartucho, um volume de 300 µL foi adicionada à “câmara de amostra” utilizando uma pipeta Pasteur que já vem incluída no kit (Figura 1). O cartucho foi fechado firmemente e inserido no equipamento, foi dado o comando de “iniciar teste” e aguardou-se a liberação dos resultados pela detecção ou não dos genes E e N2 de SARS-CoV-2.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

A partir dos resultados dos Ct (Cycle Threshold), construímos Gráficos de Pearson que nos auxiliou a verificar a correlação positiva entre as metodologias com e sem extração de RNA viral. Houve 53,99% e 71,47% de concordância entre os resultados dos Ct para os Genes E e N, respectivamente. Maioria dos resultados obtidos na detecção direta (sem extração de RNA) dos genes E e N de SARS- CoV-2 em gargarejo corresponderam ao resultados esperados (com extração).

De igual forma, ao comparar os resultados obtidos no sistema GeneXpert com os dados do RT-qPCR, verificamos uma correlação positiva entre as metodologias, com 83,05% e 86,96% de concordância entre os Ct para a detecção do Genes E e N/N2, respectivamente e, apenas uma amostra apresentou resultado discordante entre as metodologias.

Atualmente, a RT-qPCR é considerado o padrão ouro para o diagnóstico rápido e sensível da COVID-19, entretanto é um procedimento demorado e complexo, no qual a amostra é obtida por swab nasofaríngeo, o que pode causar certo desconforto ao paciente durante a coleta. Além disso, é necessário alta exposição dos profissionais para a realização da coleta e processamento. O presente estudo apresenta uma metodologia diagnóstica comercial de alta sensibilidade, com resultados mais rápidos e manipulação segura para a detecção do SARS-CoV-2, utilizando o gargarejo como amostra alternativa à secreção nasofaríngea. Utilizando a detecção direta (sem extração de RNA) foi possível detectar os genes E e N de SARS-CoV-2 por RT-qPCR em amostras de gargarejo com solução fisiológica 0,9% estéril, com correlação positiva aos realizados com a extração de RNA automatizada nas mesmas amostras. Comparados com os resultados obtidos na rotina diagnóstica, a aplicação das amostras de gargarejo aos cartuchos Xpert Xpress SARS-CoV- 2 no sistema GeneXpert se mostrou eficiente para a detecção dos genes E e N2 de SARS- CoV-2, com resultados concordantes com o teste padrão ouro (RT-qPCR).

Entretanto, na detecção direta, algumas amostras realizadas sem extração (4, 20 e 28) tiveram CT >40, resultado negativo pelo limite de detecção, nesses casos com carga viral baixa, o método sem extração automatizada pode não ser recomentada, porém em pacientes com carga viral alta (valor de CT mais baixo) esta metodologia se mostra uma boa alternativa na realização dos testes, quando, por exemplo, o laboratório não disponibilizar de kits de extração. No GeneXpert, a amostra que apresentou resultado discordantes entre as duas metodologias, detectando apenas o Gene N2, pode ser explicado devido à baixa carga viral presente na amostra, uma vez que o Cycle Treshold estava bem elevado (41,5) e o limite de detecção do teste padrão ouro é 40,0.

É relatado boa sensibilidade e especificidade na detecção do SARS-CoV-2 em amostras de gargarejo (KOCAGOZ, 2021). Neste sentido, a utilização de cartucho XpertXpress SARS-CoV-2 no Sistema GeneXpert que envolve mínima manipulação das amostras, pode ser uma alternativa segura para a detecção do vírus e para a detecção rápida do SARS-CoV-2 em amostras de gargarejo, sobretudo em profissionais de saúde, para os quais a pandemia tem se mostrado especialmente perigosa (LIPPI, 2020). Esse tipo de amostra dispensa o preparo prévio ou manuseio de micropipetas e ponteiras de diferentes capacidades, microplacas e outros reagentes. Se considerarmos tempo envolvido desde com a recepção até a liberação dos resultados utilizando o XpertXpress® SARS-CoV-2, obtivemos 1h:20min, que correspondeu a um tempo 2,3 vezes menor que o RT-qPCR. Ainda, por se tratar de material auto-coletável, a coleta não precisa ser executada por profissionais capacitados como ocorre com as secreções nasofaríngeas.

CONCLUSÕES

Concluímos que o teste GeneXpert oferece biossegurança elevada aos analistas, e também aos profissionais da coleta, uma vez que, a amostra é auto coletável e a partir da transferência da amostra para o cartucho, todas as etapas do processo são realizadas automaticamente em sistema fechado, ou seja, sem intervenção manual, reduzindo os riscos de contaminação ambiental, inter-amostras e dos profissionais. Portanto, concluímos que amostras de gargarejo podem ser utilizadas como amostras alternativas à secreção nasofaríngea utilizando o teste XpertXpress® SARS-CoV-2, no entanto não é possível a sua aplicação a todos os indivíduos, como as crianças por exemplo, que não possuem a habilidade de realizar tal procedimento. Ainda, apesar de liberar somente 4 resultados a cada ciclo de testes, é particularmente útil para a detecção da COVID-19 em profissionais da saúde, que necessitam de respostas rápidas, assim como em períodos de baixas demandas ou exames solicitações de urgência.

REFERÊNCIAS

MALFATTI, R. et al. Cardiovascular Changes Caused by COVID-19. Universidade Cruzeiro do Sul. 2020.

SBAC. Métodos laboratoriais para diagnóstico da COVID-19. Sociedade Brasileira de Análises Clínicas. 2022.

KOCAGOZ, Tanil et al. Simple concentration method enables the use of gargle and mouthwash instead of nasopharyngeal swab sampling for the diagnosis of COVID-19 by PCR. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases, v. 40, n. 12, p. 2617-2622, 2021.

LIPPI, Giuseppe et al. Biosafety measures for preventing infection from COVID-19 in clinical laboratories: IFCC Taskforce Recommendations. Clinical Chemistry and Laboratory Medicine (CCLM), v. 58, n. 7, p. 1053-1062, 2020.