Resumo expandido publicado nos Anais da III Mostra dos Trabalhos de Conclusão de Curso da Especialização em Vigilância Laboratorial em Saúde Pública. Para acessa-lo clique aqui.

Este trabalho foi escrito por:

Felipe Corrêa Rezende de Souza¹; Amanda de Oliveira Baccin²; Leyva Cecília Vieira de Melo³

¹Estudante do Curso de Especialização em Vigilância Laboratorial em Saúde Pública -CPM/IAL – CEFOR; E-mail: [email protected]

²Mestranda do Programa de Pós-graduação em Pesquisas Laboratoriais em Saúde Pública – CCD/SP – CPM/IAL; E-mail: [email protected]

³Profª Drª do Núcleo de Enteroparasitas – CPM/IAL. E-mail: [email protected]

Resumo: O nematóide Angiostrongylus cantonensis é o principal agente causador da meningite eosinofílica no mundo. Em humanos, a infecção ocorre pela ingestão acidental ou habitual de hospedeiros intermediários ou paratênicos infectados pelo metaestrongilídeo. Entretanto, para fechar um quadro de neuroangiostrongilíase é necessário associar os sintomas clínicos, dados epidemiológicos, presença de eosinofilia e/ou eosinorraquia e encontro de larvas do parasito no LCR, PCR positiva ou exames imunológicos reagentes. Contudo, cada método de diagnóstico apresenta limitações importantes, tratando-se de uma patologia de difícil identificação. Assim, torna-se fundamental a realização de pesquisas que busquem métodos mais efetivos para a execução do diagnóstico laboratorial da patologia. Neste contexto, este trabalho levantou a evolução das técnicas de diagnóstico da neuroangiostrongilíase, reunindo informações que possam auxiliar na introdução desta parasitose no rol de possíveis causas de meningite eosinofílica no Brasil. Além disso, busca também respaldar investigações epidemiológicas, laboratoriais e proporcionar conhecimento aos profissionais da saúde.

Palavras-chave: Angiostrongylus cantonensis, angiostrongilíase meningoencefálica, diagnóstico, meningite eosinofílica, neuroangiostrongilíase.

INTRODUÇÃO Angiostrongylus cantonensis (Figura 1), popularmente conhecido como “verme do pulmão do rato”, é um nematódeo heteroxeno da família Metaestrongilidae de importância médica, sendo o agente etiológico da neuroangiostrongilíase humana e a principal causa de meningite eosinofílica no mundo (WANG et al., 2008; DE-SIMONE et al., 2022). Em seu ciclo de vida, seres humanos entram como hospedeiros acidentais após ingerirem de forma proposital, ou acidental, hospedeiros intermediários (caracóis, lesmas e caramujos) ou paratênicos (como crustáceos e planárias).

Devido a fatores biológicos, em especial a resposta imune do hospedeiro acidental, ocorre a morte das larvas ao chegarem ao sistema nervoso central, iniciando o quadro de meningite ou meningoencefalite, com acentuada presença de eosinófilos (ALICATA, 1965).

Trata-se de doença de difícil diagnóstico, pois além de seus sintomas serem facilmente confundidos com outras etiologias, a ocorrência de reações cruzadas com outras helmintíases, em testes imunológicos, representa fator limitante na conclusão dos casos (EAMSOBHANA e YONG, 2009).

Outro agravante é o fato de que o conhecimento a respeito da doença e seu diagnóstico estão pulverizados, pois as pesquisas sobre o assunto vêm sendo executadas por grupos isolados, distribuídos pelo mundo. Assim, muitos profissionais da saúde têm pouco acesso às informações, sendo que a maioria sequer conhece a patologia. Neste contexto, este trabalho busca levantar dados sobre a evolução das técnicas de diagnóstico, reunindo informações que possam auxiliar na introdução da neuroangiostrongilíase no rol de hipóteses diagnósticas em casos de meningite eosinofílica; respaldar investigações epidemiológicas e pesquisas laboratoriais; e proporcionar conhecimento aos profissionais da saúde.

MATERIAL E MÉTODOS

Trata-se de uma revisão de literatura, em nível mundial, efetuada nas bases de dados PubMed, Scielo, Embase, Google Acadêmico, sites oficiais de jornais científicos (que disponibilizam suas edições online) e bibliotecas digitais de livre acesso, independente da data de publicação. Para tanto, foram utilizadas as palavras-chave em português e suas traduções em inglês: “Angiostrongylus cantonensis”, “diagnóstico”, “neuroangiostrongilíase”, “meningite eosinofílica” e “angiostrongilíase meningoencefálica”, aplicando-se os filtros “review“, “case reports”, “publication date” e “descendingorder”.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

A partir dos artigos encontrados nas bases de dados acessadas, foi possível estabelecer a linha do tempo sobre a evolução do diagnóstico da neuroangiostrongilíase (Figura 2). Os artigos apresentaram de forma clara ou subentendida as limitações de cada técnica, sendo estas relacionadas com sensibilidade, especificidade, custo, necessidade de profissionais capacitados, entre outras.

Além disso, foi possível entender que, embora as técnicas tenham sido aprimoradas ao longo do tempo, os critérios para fechamento de casos ainda permanecem os mesmos: sintomas clínicos compatíveis com meningite ou meningoencefalite, presença de eosinofilia e/ou eosinorraquia, contato com hospedeiros intermediários e resultados de exames imunológicos compatíveis com a doença. Foi percebido também que, para aprimorar o diagnóstico da neuroangiostrongilíase é necessário analisar e compreender a utilidade de cada método, conforme citado a seguir:

Método direto: este foi utilizado no primeiro caso de neuroangiostrongilíase em 1945, por Nomura e Lin, com o achado de larvas no LCR de pacientes com sintomatologia de meningite. Depois deste, poucos casos foram diagnosticados com essa técnica, como por exemplo, no trabalho publicado por Chen et al. (1979), que recuperaram larvas no LCR de 25/259 pacientes e os testes de Punyagupta (1969), que encontraram larvas em 19/454 pacientes, ambos na Ásia (VITTA, 2012).  Apesar de ser considerado o diagnóstico definitivo, a recuperação de formas imaturas do parasito no LCR ou nos olhos é rara, necessitando de embasamento em características clínicas e resultados laboratoriais (EAMSOBHANA, YONG, 2009).

Teste intradérmico (TID): direcionado para confirmar ou excluir a hipersensibilidade a antígenos de extratos biológicos e químicos que desencadeiam processos de defesa na derme. Consiste na injeção de pequenas frações de antígenos, atravessando a camada superficial e avascular da pele para provocar respostas celulares e humorais de IgE e/ou IgG. Assim, a reação positiva é observada pela formação de eritema e pápula na região de aplicação. Em relação à neuroangiostrongilíase, o TID foi adaptado por Alicata e Brown (1962) para diagnosticar a infecção humana a partir da metodologia de Egashira (1951), utilizando extratos pulverizados de vermes adultos de A. cantonensis. Assim, o objetivo deste experimento foi encontrar um método mais eficiente do que a pesquisa direta de larvas no LCR, devido à sua baixa sensibilidade. Entretanto, logo nos testes iniciais ficou evidente a quantidade de reações cruzadas que esta técnica apresenta, tendo reações positivas frequentemente desencadeadas em indivíduos assintomáticos ou pacientes com outras parasitoses, não sendo indicada para o diagnóstico da neuroangiostrongilíase.

Testes de aglutinação: o ensaio de hemaglutinação é um dos métodos indiretos mais comuns para identificar partículas antigênicas em suspensão ao envolver o fenômeno de agregação de glóbulos vermelhos na presença de partículas hemaglutinantes. Além disso, hemácias podem ser substituídas por partículas de látex, sendo outro teste que utiliza o mesmo princípio, com a diferença da sensibilização do látex com anticorpos específicos. No que se refere ao diagnóstico da neuroangiostrongilíase, em 1969 Kamiya e colaboradores utilizaram a hemaglutinação indireta para testar a detecção de infecções por A. cantonensis em amostras de soro de 40 ratos albinos experimentalmente infectados pelo nematódeo, obtendo títulos de 1:32 até 1:16.384, no período em que os animais iniciaram a eliminação de larvas nas fezes. Entretanto, em seres humanos, os testes de hemaglutinação mostram que os anticorpos podem aumentar rapidamente em um mês e diminuir de seis a 12 meses após a infecção. Posteriormente, Mishra et al. (1970) utilizaram aglutinação em látex para determinar reações sorológicas em roedores experimentalmente infectados por A. cantonensis na França. Como resultado, os autores detectaram as primeiras reações positivas a partir do quinto dia após a ingestão das larvas. Em humanos foi utilizado por Uga et al., 1996, para excluir casos suspeitos com toxoplasmose, porém, na literatura, não há dados relatados sobre a sensibilidade e especificidade do teste de látex para A. cantonensis.

Imunodifusão e contraimunoeletroforese: as técnicas foram aplicadas no diagnóstico da neuroangiostrongilíase por Mishra e Bénex em 1970 e Bouthemy et al. em 1972, utilizando extratos de vermes de A. cantonensis e soros de ratos infectados, em ciclo experimental, para detectar os anticorpos e comprovar a reação imunológica dos animais frente ao parasito. Porém, em seres humanos, como ocorre em outras técnicas já citadas, foram constatadas reações cruzadas com outras helmintíases. Desta forma, a imudifusão e a contraimunoeletroforese foram utilizadas apenas para confirmar outros métodos sorológicos e/ou moleculares aplicados em um caso suspeito (BARRATT et al., 2016).

Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI): tem como base a ligação imunohistoquímica para detectar a reação antígeno-anticorpo padrão, onde anticorpos específicos reconhecem e se unem ao antígeno, emitindo fótons sobre luz ultravioleta. Assim como na imunodifusão, a imunofluorescência com A. cantonensis teve seu primeiro registro no mesmo experimento de Mishra e Bénex (1970), que se basearam na metodologia de Ambroise-Thomas (1969), para obter uma fluorescência verde-amarelada das larvas, após a utilização de soros de modelo murino com infecção patente, em extratos antigênicos de A. cantonensis. É importante ressaltar que a imunofluorescência indireta, apesar da sua sensibilidade mais elevada do que a reação direta para o diagnóstico de A. cantonensis, é comumente utilizada apenas como critério de inclusão e suspeita de caso, devido seus resultados cruzados com outras helmintíases (DARD et al., 2020).

Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay (ELISA) e Dot-ELISA: o método de ELISA para o diagnóstico da neuroangiostrongilíase tem seu primeiro relato datado de 1982, em Taiwan, quando foram examinados os soros de crianças com meningite eosinofílica. Para tal, os pesquisadores usaram extratos brutos de A. cantonensis preparados a partir de larvas de quarto estágio (recuperadas de cérebros de ratos experimentalmente infectados). Devido à baixa especificidade, em 1991, Yen e Chen adaptaram a técnica usando extratos parcialmente purificados do parasita, porém os experimentos também apresentaram reações cruzadas com outras parasitoses, o que levou os pesquisadores a buscarem alternativas em estudos com imunoblot. Assim, atualmente o diagnóstico imunológico da patologia é realizado por testes de detecção de anticorpos anti-A. cantonensis, tendo ELISA ou Dot-ELISA como métodos de triagem e Western blot como confirmatório (COGNATO et al. 2020).

Western blotting: procedimento de imunodetecção de proteínas, que envolve a transferência de padrões proteicos de um gel para uma membrana microporosa. Foi utilizado no diagnóstico da neuroangiostrongilíase com base em antígenos de 29kDa e 31kDa, de extrato bruto de vermes adultos, purificados por eletroforese em gel de SDS-poliacrilamida. Esses antígenos foram reativos apenas com o soro de pacientes com angiostrongilíase. A técnica foi aplicada em 1991 e, ainda hoje, é utilizada como teste confirmatório para o diagnóstico da doença. Entretanto, conforme apontado em outros estudos, a técnica não apresenta 100% de precisão, levantando a necessidade de aprofundamento nos estudos sobre a fonte de antígenos usada no diagnóstico (EAMSOBHANA e YONG, 2009; BARRATT et al., 2016).

Reação em Cadeia da Polimerase (PCR): trata-se de uma técnica amplamente utilizada na pesquisa e para o diagnóstico de doenças, clonagem e sequenciamento de genes. Dentre suas múltiplas vantagens, podemos citar sua simplicidade, fácil execução e o fato de ser altamente sensível e específica. Além disso, a PCR em tempo real (qPCR) ainda detém a capacidade de quantificar o produto sintetizado. Na história da neuroangiostrongilíase, a técnica molecular só foi utilizada para o diagnóstico em 2003, após a descrição de análises filogenéticas de metaestrongilídeos por Carrero e Nadler e, em 2007, por meio de um ensaio de PCR convencional, criado pelo CDC (Centers for Disease Control and Prevention), amplificou um fragmento de 1134 pares de base do gene 18S de RNA ribossomal (rRNA) (MORASSUTTI et al., 2014). Somente após 2010 testes de qPCR foram desenvolvidos para identificar larvas L3 em invertebrados, com a finalidade de diagnósticos ambientais. Recentemente, diretrizes atualizadas para o diagnóstico e tratamento da neuroangiostrongilíase indicam que seja feito o diagnóstico presuntivo, a partir de sinais e sintomas característicos de meningite, presença de eosinofilia e/ou eusinorraquia e histórico de contato com moluscos ou hospedeiros paratênicos. Além disso, alguns países, como o Brasil, utilizam também exames imunológicos para ajudar na interpretação dos casos. Entretanto, a confirmação do quadro só é dada a partir de resultados positivos da qPCR, caso haja disponibilidade, ou encontro de larvas no exame direto. É importante salientar que a qPCR pode ser negativa no início da infecção, indica- se a repetição do exame após 5 a 10 dias se a suspeita de angiostrongilíase meningoencefálica persistir (ANSDELL et al., 2021).

Sequenciamento genômico e MicroRNA (miRNA): estudos com sequenciamento genético vêm sendo aprimorados e mais de 800 sequências de nucleotídeos, 699 sequências de proteínas e 43 genes de Angiostrongylusforam depositados no GenBank. Além disso, abordagens de sequenciamento de última geração têm permitido uma análise mais rápida, com a anotação de uma grande quantidade de genomas de organismos variados. Assim, estratégias que permitam fechar as lacunas na identificação de potenciais alvos de diagnóstico estão sendo estudadas (MORASSUTTI et al., 2013). Dentre elas, a possibilidade de encontrar microRNAs com especificidade elevada de A. cantonensis tem demonstrado potencial diagnóstico. Porém, estudos com a utilização destas técnicas para o diagnóstico da neuroagiostrongilíse, embora sejam promissores, parecem estar em uma fase silenciosa, onde não são encontrados trabalhos mais recentes, mostrando que ainda está longe de se ter testes disponíveis desta natureza para uso em laboratórios clínicos (BARRATT et al., 2016).

           

CONCLUSÕES

De acordo com os dados levantados, foi possível compreender que a evolução do diagnóstico laboratorial da neuroangiostrongilíase tem sido marcado pela tentativa de melhoria da especificidade dos testes, sendo que os testes mais específicos (pesquisa de larva no LCR e qPCR) possuem sensibilidades associadas à elevada carga parasitária e fase aguda da doença. Outras técnicas moleculares parecem ser promissoras, mas ainda não existe previsão de sua aplicabilidade em diagnóstico. 

Diante do exposto, este estudo sugere que é possível conciliar as vantagens e desvantagens dos testes já desenvolvidos para a elaboração de um fluxo diagnóstico de forma a integrar resultados laboratoriais, opiniões de médicos e cientistas, além das ações das vigilâncias epidemiológica e sanitária para o correto fechamento de casos.

REFERÊNCIAS

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