Capítulo de livro publicado no Congresso Brasileiro de Química dos Produtos Naturais. Para acessa-lo clique aqui.

Este trabalho foi escrito por:

Isamara Reis Gomes ^*; Éder Dutra de Resende ;

Laboratório de Tecnologia de Alimentos, Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro, Av. Aberto Lamego, 2000, Parque Califórnia, 28013-602, Campos dos Goytacazes – RJ

*Autor correspondente (Corresponding author) – Email:[email protected]

Resumo: O fungo Colletotrichum gloesporioides é o principal causador da doença antracnose em frutos de mamoeiros. Esta doença se caracteriza por lesionar o fruto, deixando-o impróprio para o consumo, resultando em grandes perdas pós-colheita do mamão. Diversas tecnologias têm sido testadas para controle desse fungo, dentre elas o uso de fungicidas sintéticos, mas o uso de revestimento ativo incorporado com produtos antimicrobianos com óleos e extratos vegetais tem se tornado uma tecnologia emergente, por se tratar de um produto natural, de fácil manipulação e de baixo custo. O objetivo do trabalho é avaliar a Concentração Mínima Inibitória (CMI) de Momordica charantia L. para controle do crescimento de Colletotrichum gloesporioides. Desta forma, o estudo da metodologia de produção, aplicação e utilização do revestimento ativo de amido de mandioca incorporado com extrato de Momordica charantia L. se mostrou efetivo no controle in vitro do crescimento de Colletotrichum gloesporioides. A Concentração Mínima Inibitória (CMI) do extrato no revestimento ativo foi de 1,174% de massa seca do extrato aquoso,possibilitando 99% de inibição do crescimento do fungo, mostrando o potencial deste extrato aquoso para ser utilizado no controle do fungo Colletotrichum gloesporioides.

Palavras–chave: Extrato aquoso, Inibição do crescimento micelial, Revestimento ativo

Abstract: The fungus Colletotrichum gloesporioides is the main cause of anthracnose disease in papaya fruits. This disease is characterized by injuring the fruit, leaving it inappropriate for consumption, resulting in large post-harvest papaya losses. Several technologies have been tested to control this fungus, including the use of synthetic fungicides, but the use of active coating incorporated with antimicrobial products with oils and plant extracts has become an emerging technology, as it is a natural product, easy to handling and low cost. The objective of this work is to evaluate the Minimum Inhibitory Concentration (MIC) of Momordica charantia L. extract to control the growth of Colletotrichum gloesporioides. Thus, the study of the production methodology, application and use of the active coating of cassava starch incorporated with Momordica charantia L. extract proved to be effective in controlling the in vitro growth of Colletotrichum gloesporioides. The Minimum Inhibitory Concentration (MIC) of the extract in the active coating was 1.174% of dry mass of the aqueous extract, enabling 99% inhibition of fungal growth, showing the potential of this aqueous extract to be used in the control of fungus Colletotrichum gloesporioides.

Key Word: Aqueous extract, Inhibition of mycelial growth, active coating

INTRODUÇÃO

Segundo a FAO (1), o Brasil é o segundo maior produtor de mamão do mundo, ficando atrás somente da Índia. Esta grande produção de mamão no Brasil é graças as condições climáticas do país tropical que favorece o cultivo da planta.

O fruto de mamão sofre grandes perdas na produção provocadas por doenças fúngicas, dentre estas doenças a antracnose tem grande destaque. Esta doença é provocada pelo fungo Colletotrichum gloesporioides que produz uma lesão na superfície do fruto, deixando-o impróprio para o consumo (2).

            Diversas tecnologias vêm sendo utilizadas para o controle fúngico do Colletotrichum gloesporioides e aumento da vida útil do fruto de mamão, tais como o uso de refrigeração, tratamentos químicos, uso de embalagens de atmosfera modificada, uso de revestimentos ativos, aplicação de extratos vegetais e óleos essenciais, dentre outros, minimizando assim as perdas pós-colheita e aumentando a validade comercial do mamão (3).  

            Os revestimentos ativos são películas de espessuras variadas, oriundos de substâncias naturais ou sintéticas, que não apresentam riscos à saúde do consumidor e que conseguem interagir com a estrutura do produto (4).

       O amido de mandioca é um polissacarídeo abundante na natureza, e o mais utilizado para elaboração de coberturas comestíveis, é um produto de baixo custo e alta disponibilidade, é de fácil manipulação, é um produto biodegradável, contribuindo para uma menor poluição ambiental, quando lançado no meio ambiente (5).

            Alguns produtos naturais tais como extratos vegetais tem se tornado uma tecnologia emergente, muito utilizado para o controle fúngico em frutos e vegetais. O extrato aquoso de folhas de Momordica charantia L. apresenta em sua composição, compostos bioativos como, alcaloides, flavonoides, saponinas, taninos, glicosídeos e esteroidesque apresentam atividade antimicrobiana (6). Já existem diversos trabalhos na literatura mostrando estudos da eficiência antifúngica de extratos de Momordica charantia L. na inibição do fungo Colletotrichum gloesporioides (7; 8; 9).

O presente trabalho buscou avaliar a Concentração Mínima Inibitória (CMI) de Momordica charantia L. para controle do crescimento de Colletotrichum gloesporioides. A presente pesquisa é importante pois se mostra uma alternativa sustentável, com uso de um promissor antifúngico natural, produto do metabolismo secundário de plantas, que promove inibição do crescimento micelial do fungo Colletotrichum gloesporioides, responsável por grandes perdas na produção de mamão.

MATERIAL E MÉTODOS

O fungo Colletotrichum gloeosporioides foi isolado diretamente de frutos de mamão Caricapa paya L., que foram mantidos em câmara de incubação BOD (SP Labor) na temperatura de 25 ºC, até adquirirem sintomas da doença e sinais de patógeno.

O revestimento à base de amido de mandioca foi preparado na concentração de 6% de fécula de mandioca da marca PATUSCO, adquirido em supermercado de Campos dos Goytacazes (RJ).

O extrato foi preparado com folhas de Momordica charantia L. colhidas na  Zona da Mata Mineira (Latitude: -20.906657 e longitude: -42.240492), Eugenópolis e transportadas até o laboratório (LTA/UENF), onde foram higienizadas e processadas em secador de bandejas (Pardal), na temperatura de 50 ^oC com ventilação forçada de ar, durante 24 horas. Após secagem, as folhas foram trituradas em moinho analítico (marca QUIMIS) até obtenção de pó com granulometria de 0. 297 mm (peneira de 50 MASH). O pó do extrato seco foi utilizado na infusão para preparo do extrato aquoso.

Para preparar o extrato aquoso de Momordica charantia L., o extrato seco foi pesado em balança analítica de acordo com a concentração utilizada. Utilizou-se a técnica de infusão para o preparo. A água destilada foi previamente aquecida em chapa aquecedora até a temperatura de 80 ^oC, em seguida foi adicionada a proporção de massa de extrato seco adequada para cada concentração do revestimento. O material foi mantido sob agitação por 2 minutos para homogeneização do extrato e possibilitar a extração dos componentes ativos, sendo então filtrado em filtro de papel, resfriado e acondicionado em frasco estéril na geladeira. Foram usados extratos nas concentrações de 0%, 0,143%, 0,286%, 0,572%, 0,858%, 1,144%, 1,430%, 1,716%, 2,002% e 2,288% de massa seca (g 100 mL^-1) para os testes in vitro.

Previamente ao experimento, foram definidas as porcentagens de massa seca em cada volume de extrato líquido, mediante análises de umidade em estufa (Quimis), a 105 ^oC por 24 horas, a fim de quantificar a massa seca de cada volume de extrato (g 100 mL^-1).

A incorporação do extrato aquoso de Momordica charantia L. no revestimento ativo foi padronizada com um volume constante de 10 mL de extrato aquoso, para cada 40 mL de revestimento de fécula de mandioca (6%).

A homogeneização e incorporação do extrato líquido no revestimento foram feitas por meio de agitação (Turratec TE), a 10.000 rpm por 20 min. A definição da faixa de concentrações baseou-se em experimentos preliminares, em que foram testadas concentrações máximas para inibição completa do crescimento do fungo.

Placas de Petri foram preparadas com 20 mL de meio de cultura BDA (batata 200 g/l, dextrose 20 g/l, ágar 20 g/l) da marca KASVI, devidamente esterilizado em Autoclave, com temperatura de 120 °C e pressão de 1 kgf/cm², por 15 min e acidificado com ácido tartárico. Após solidificação do meio BDA e a formação de uma camada regular em toda a placa de Petri, estas receberam um volume de 10 mL de revestimento ativo incorporado com o extrato aquoso e foram acondicionadas em geladeira por 24 h, com temperatura de 10 ºC para solidificação do revestimento na placa.

A inoculação foi realizada em câmara de fluxo laminar, utilizando um inóculo de 5 mm de diâmetro do micélio de C. gloeosporioides que foi repicado para o centro de cada placa de Petri de 9 cm de diâmetro, as quais foram vedadas com filme PVC e mantidas em B.O.D. na temperatura de 25 °C, até que as amostras controles atingissem 2/3 do diâmetro da placa. A avaliação do crescimento micelial foi verificada a cada dia, pela mensuração do diâmetro das colônias, em quatro direções diametralmente opostas, obtendo-se a média dos diâmetros de desenvolvimento dos micélios. Ao fim de 7 d foi calculada a área do crescimento do micélio, levando em consideração a área de um círculo, conforme a Equação 1.

A = πr²                                                                                                                      (Eq. 1)

Em que:

A = área do micélio (cm²)

π = valor de “pi”

r = valor do raio de círculo do micélio (cm)

O delineamento experimental utilizado foi o inteiramente casualizado,  constituído de dez tratamentos com diferentes concentrações de matéria seca no extrato: de 0%; 0,143%; 0,286%; 0,572 %; 0,858%; 1,144%; 1,430%; 1,716%; 2,002% e 2,288%, com quatro repetições para cada tratamento, sendo o tratamento controle representado por 0% de extrato, relativo ao raio medido na placa em que o fungo é depositado somente em meio BDA.

A concentração mínima inibitória (CMI) foi obtida a partir do ajuste de um modelo não-linear, que descreve a correlação entre a área de crescimento do fungo (cm²) em função da concentração de matéria seca do extrato de Momordica charantia L. no revestimento (g 100 mL^-1). A CMI foi definida no ponto da curva em que a concentração de matéria seca do extrato no revestimento inibe o crescimento total do fungo, aos 7 d de incubação em B.O.D. a 28 ^oC.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

O aumento da concentração do extrato no revestimento ativo promove uma inibição parcial ou total do crescimento do fungo à medida que se aumenta o teor de matéria seca do extrato no revestimento. Resultados similares foram obtidos por Venturosos et al. (9) e Silva et al. (8). 

Ao final de 7 d de incubação nota-se que o tratamento controle já tinha atingido quase toda a superfície da placa de Petri, enquanto nos outros tratamentos observa-se menor área de crescimento micelial à medida que se aumenta a concentração de massa seca do extrato no revestimento, conforme ilustrado na Figura 1.

O tratamento controle apresentou área de crescimento do fungo de 37,65 cm² após 7 d de incubação a 28 ºC, ocorrendo redução desta área à medida que se aumentou a concentração de massa seca no extrato no revestimento ativo. Resultados similares foram encontrados por Silva et al. (8), em seu trabalho com uso do extrato de Momordica charantia L. para inibição do crescimento micelial de Colletotrichum gloeosporioides.

O tratamento com o revestimento contendo 0,143% de massa seca do extrato foi o que apresentou a menor inibição do crescimento micelial, com uma área de crescimento de 30,18 cm². No entanto, o revestimento contendo 2,288% de massa seca do extrato, apresentou grande capacidade de inibição do fungo, com uma área de crescimento residual de 0,01 cm². Nota-se na Figura 2 que o revestimento ativo contendo 0,856% de matéria seca do extrato já alcançou valores muito altos de inibição do fungo, porém, esse efeito de inibição segue uma curva definida por um modelo exponencial decrescente que tende a um valor residual mínimo.

A concentração mínima inibitória (CMI) foi calculada levando em consideração a porcentagem de matéria seca do extrato, que garante a inibição de 99% da área de crescimento do fungo. O modelo adimensional de ajuste da curva está indicado na Equação 2. Este modelo descreve a porcentagem de inibição do crescimento do fungo, tendo como estado de referência o crescimento máximo de 100% no tratamento controle. A CMI para o fungo Colletotrichum gloeosporioides foi atingida com concentração de 1,174% de matéria seca no extrato.

e –λx (1+ λx) – (1-pc) = 0                                                                             (Eq. 2)

Em que:

λ = Valor de lambda calculado previamente no ajuste do modelo aos dados

experimentais (5,6544)

x = concentração de matéria seca do extrato no revestimento ativo (%)

pc = Porcentagem de inibição (0,99)

As placas dos tratamentos que apresentaram alta capacidade de inibição permaneceram incubadas por um período de 20 d, a fim de se observar a efetividade da inibição do crescimento micelial por um período maior de tempo, notando-se que mesmo após 20 d de incubação, as placas não apresentaram crescimento significativo.

Segundo Celoto et al. (7), extratos aquosos e hidroetanólico, obtidos de folhas e ramos de Momordica charantia L, na concentração de 50% em relação ao volume adicionado em meio sólido, proporcionaram 71% e 65% de inibição do crescimento micelial do fungo Colletotrichum gloeosporioides.

CONCLUSÕES

O extrato de Momordica charantia L. foi eficiente para controle do crescimento in vitro do fungo Colletotrichum gloeosporioides. A Concentração Mínima Inibitória (CMI) do extrato no revestimento ativo é de 1,174% de massa seca do extrato aquoso,possibilitando 99% de inibição do crescimento do fungo.

AGRADECIMENTOS

Agradeço a UENF pela oportunidade de desenvolvimento do trabalho, à FAPERJ pelo apoio financeiro e à CAPES pela bolsa de estudos.

REFERÊNCIAS

1. FAO. Food and Agriculture Organization of the United Nations (2019). Disponível em: http://www.fao.org/statistics/en/. Acessado em: dezembro, de 2022.
2. TAN, Guang Heng; ALI, Asgar; SIDDIQUI, Yasmeen. Current strategies, perspectives and challenges in management and control of postharvest diseases of papaya. Scientia Horticulturae, v. 301, p. 111139, 2022.
3. DE OLIVEIRA, Vanessa Caroline; MENDES, Fabrícia Queiroz. Técnicas de preservação pós-colheita de frutas e hortaliças: uma revisão narrativa. Ciência e tecnologia de alimentos: pesquisa e práticas contemporâneas. 2021- Volume 2. 720:722.
4. Maia, L. H.; Porte, A.; DE SOUZA, V. F. (2000). Filmes comestíveis: aspectos gerais, propriedades de barreira a umidade e oxigênio. Boletim do Centro de Pesquisa de Processamento de Alimentos, 18(1).
5. Sapper, M.; Chiralt, A. (2018). Starch-based coatings for preservation of fruits and vegetables. Coatings, v. 8, n. 5, p. 152.
6. Mada, S. B.; Garba, A.; Mohammed, H. A.; Muhammad, A.; Olagunju, A.; Muhammad, A. B. (2013). Antimicrobial activity and phytochemical screening of aqueous and ethanol extracts of Momordica charantia L. leaves. Journal of Medicinal Plants Research, 7(10), 579-586.
7. Celoto, M. I. B.; Papa, M. F. S.; Sacramento, L. V. S.; Celoto, F. J. (2011). Atividade antifúngica de extratos de Momordica charantia L. sobre Colletotrichum musae. Revista Brasileira de plantas medicinais, 13(3), 337-341.
8. da Silva, J. G., Melo, R. P., Araújo, J. D. M., Pessoa, M. N. G., Albiero, D., & de Almeida Monteiro, L. (2011). 10455-Avaliação de extrato de melão de são caetano (Momordica charantia L.) como medida alternativa de controle a fungos fitopatogênicos. Cadernos de Agroecologia, 6(2).
9. Venturoso, L. D. R.; Bacchi, L. M. A.; Gavassoni, W. L.; Conus, L. A.; Pontim, B. C. A.; Bergamin, A. C. (2011). Atividade antifúngica de extratos vegetais sobre o desenvolvimento de fitopatógenos. Summa Phytopathologica, 37(1), 18-23.