Capítulo de livro publicado no Congresso Brasileiro de Química dos Produtos Naturais. Para acessa-lo clique aqui.

Este trabalho foi escrito por:

Michelle Carlota Gonçalves *; Mônica Aparecida da Silva ; Bruna Azevedo Balduíno ; Anderson Henrique Venâncio ; Juliana Junqueira Pinelli ; Monique Suela Silva ; Roberta Hilsdorf Piccoli  

*Autor correspondente (Corresponding author) – Email: [email protected]

Resumo: Escherichia coli Enterotoxigênica (ETEC) é uma bactéria patogênica que pode causar desde simples diarreia até a morte em crianças e indivíduos imunocomprometidos. Por serem veiculadas por alimentos, principalmente os de origem animal, seu controle é de grande importância. A inibição ou a morte dessa bactéria podem ser causadas pela adição de conservantes ao alimento. Entretanto, essas substâncias, muitas vezes, podem causar impactos negativos na saúde do consumidor. Assim, substâncias naturais têm sido sugeridas como alternativa aos conservantes químicos. O óleo essencial de Origanum vulgare (orégano), apresenta elevada atividade antimicrobiana e de amplo espectro contra patógenos alimentares. Entretanto, quando utilizado em concentração subletal, pode induzir a respostas fisiológicas bacterianas, levando à diminuição de sua suscetibilidade. Diante do exposto, verificar a capacidade de adaptação de ETEC ao óleo essencial de orégano, torna-se necessário. Inicialmente, a concentração mínima bactericida (CMB) do óleo essencial foi determinada e posteriormente as células bacterianas foram submetidas a dose subletal de ¼ da CMB do óleo essencial e após o período de incubação, as células foram expostas a concentrações variando de 0,5xCMB a 2xCMB para testar a capacidade adaptativa e esta foi determinada pelo crescimento em concentração igual ou maior que a CMB, anteriormente letal a bactéria. ETEC desenvolveu capacidade adaptativa por crescer em até 2xCMB. A pré-exposição de ETEC a concentração subletal do óleo essencial de orégano promoveu a adaptação da bactéria. O óleo essencial de orégano é uma opção promissora de antimicrobiano e sanitizante a ser utilizado na indústria de alimentos, desde que em concentrações adequadas.

Palavras–chave: ÓLEO ESSENCIAL, CANTIMICROBIANO NATURAL, BACTÉRIA PATOGÊNICA.

Abstract: Enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC) is a pathogenic bacteria that can cause anything from simple diarrhea to death in children and immunocompromised individuals. Because they are transmitted by food, especially those of animal origin, their control is of great importance. The inhibition or death of this bacteria can be caused by the addition of preservatives to the food. However, these substances can often cause negative impacts on consumer health. Thus, natural substances have been suggested as an alternative to chemical preservatives. The essential oil of Origanum vulgare (oregano) has high antimicrobial and broad-spectrum activity against foodborne pathogens. However, when used in sublethal concentrations, it can induce bacterial physiological responses, leading to a decrease in its susceptibility. Given the above, it is necessary to verify the ability of ETEC to adapt to the essential oil of oregano. Initially, the minimum bactericidal concentration (CMB) of the essential oil was determined and later the bacterial cells were subjected to a sublethal dose of ¼ of the CMB of the essential oil and after the incubation period, the cells were exposed to concentrations ranging from 0.5xCMB to 2xCMB to test the adaptive capacity and this was determined by growth in a concentration equal to or greater than the CMB, previously lethal to the bacteria. ETEC has developed adaptive capacity by growing up to 2xCMB. Pre-exposure of ETEC to a sublethal concentration of oregano essential oil promoted bacterial adaptation. The essential oil of oregano is a promising antimicrobial and sanitizing option to be used in the food industry, as long as in adequate concentrations.

Key Words: ESSENTIAL OIL; NATURAL ANTIMICROBIAL; PATHOGENIC BACTERIA.

INTRODUÇÃO

Escherichia coli é habitante comensal do trato entérico de humanos e animais sadios e acredita-se que desempenha papel benéfico ao hospedeiro, sendo capaz de sintetizar vitaminas, impedir o estabelecimento bem como favorecer a eliminação de linhagens patogênicas de E. coli (1). A presença de cepas não patogênicas em alimentos indica contaminação direta ou indireta de origem fecal, sendo considerado o indicador de possível presença de microrganismos patogênicos. Contagens elevadas de E.coli também podem estar relacionadas à falta de higiene e à falha no processamento de alimentos (2).
Escherichia coli Enterotoxigênica (ETEC) é responsável por cerca de 200 milhões de casos de diarreia e 380 mil mortes por ano, principalmente em crianças menores de cinco anos de idade (3, 4). Provoca infecções caracterizadas por diarreia aquosa, vômitos, dores de estômago, náuseas e, em alguns casos, febre moderada, sendo estas infecções autolimitadas em indivíduos saudáveis, podendo levar a graves consequências em pessoas imunocomprometidas (5). O distúrbio transmitido pela ETEC é conhecido como “diarreia dos viajantes”, por acometer pessoas que visitam áreas endêmicas (6).
Enterotoxinas são produzidas nos órgãos intestinais, causando, principalmente, dores abdominais, diarreias e vômitos, sendo consideradas uma das causas de toxinfecção alimentar. Duas enterotoxinas são produzidas por ETEC, a toxina termolábil (LT) e a toxina termoestável (ST), podendo ser expressa uma ou ambas as toxinas pela mesma estirpe (7). Seus fatores de colonização permitem a colonização do intestino delgado, causando secreção líquida no lúmen intestinal (7,8).
A segurança alimentar relacionada à saúde pública tem sido considerada problema crítico de saúde e esta área tem recebido atenção crescente, nos últimos anos. Infecção alimentar causada por E.coli, em especial por ETEC, é um problema emergente em indústrias produtoras de alimentos de origem animal, devido ao desenvolvimento progressivo da adaptação microbiana aos sanitizantes e conservantes utilizados. Com isso, pesquisas vêm sendo realizadas com o objetivo de desenvolver novos métodos de controle que não permitam a adaptação microbiana. A adição de conservantes aos alimentos pode inibir o crescimento de ETEC, porém, deve-se considerar a crescente preocupação dos consumidores em relação à saúde e à segurança alimentar. Alguns agentes antibacterianos de origem natural, tais como os óleos essenciais, apresentam a atividade antimicrobiana desejada.
Óleos essenciais, também chamados de óleos voláteis ou etéreos, são produtos oriundos do metabolismo secundário de plantas, sendo constituídos quimicamente por terpenoides e fenilpropanoides. Estes óleos são misturas naturais complexas constituídas por 20 a 60 componentes presentes em diferentes concentrações e apresentam alguns componentes principais, denominados majoritários, que determinam suas propriedades biológicas(14).
A espécie Origanum vulgare é uma planta perene, aromática e condimentar pertencente à família Lamiaceae e conhecida como orégano, manjerona-silvestre ou manjerona-rasteira. É uma planta herbácea, rasteira ou decumbente (9). O orégano emana um perfume fresco, intenso, herbáceo, sendo utilizado para fins aromáticos e condimentares. Seu óleo essencial é considerado como potente bactericida e fungicida reconhecido cientificamente.
Silva Júnior e Verona (9), pesquisando os extratos da planta de orégano, verificaram a presença de sabineno, cis-ocimeno, p-cimeno e cariofileno. Esses foram responsáveis pelas atividades antioxidantes, expectorantes, digestivas e anti-inflamatórias. Lee, Cheng e Chang (10) encontraram no óleo essencial das folhas a presença dos componentes majoritários timol e carvacrol, que se mostraram eficientes como antioxidantes, tanto que essa propriedade foi comparada à conhecida atividade da vitamina E e BHT.
Vários estudos têm focado sobre as propriedades biológicas do óleo essencial de Origanum vulgare e seus principais constituintes (11). O. vulgare, vulgarmente conhecido como orégano, possui muitas propriedades terapêuticas (por exemplo diaforética, antiinflamatório, anti-séptico, carminativo e antiespasmódico) que são utilizados na medicina nativa por muito tempo. O óleo essencial tem apresentado resultados interessantes na inibição do crescimento de bactérias, fungos e síntese de metabólitos microbianos (12, 13).
Os óleos essenciais são, de modo geral, considerados seguros e com baixa probabilidade de levar ao aparecimento de cepas bacterianas resistentes, devido à sua complexidade química e múltiplas formas de ação sobre os microrganismos, alterando a morfologia celular, interferindo na dupla camada fosfolipídica da parede celular da bactéria, levando ao aumento da permeabilidade e à perda dos constituintes celulares, e alterando uma variedade de sistemas enzimáticos, como os envolvidos na produção de energia celular e na síntese de componentes estruturais(14). Entretanto, a utilização de concentrações inadequadas dos pode levar à adaptação das células expostas a concentrações subletais, fornecendo proteção à subsequente exposição a esse estresse, gerando graves problemas relacionados à inocuidade dos produtos e à saúde do consumidor, além de causar danos econômicos para as indústrias alimentícias. Assim, definir a concentração correta de uso do óleo essencial de orégano, utilizado como antibacteriano, a fim de que não induzam a tolerância, se torna importante. Diante do exposto, este trabalho foi realizado com o objetivo de avaliar a capacidade de E.coli Enterotoxigênica (ETEC) se adaptar ao óleo essencial de orégano.

MATERIAL E MÉTODOS
Local de condução do experimento
O estudo foi conduzido no Laboratório de Microbiologia de Alimentos, no Departamento de Ciências dos Alimentos da Universidade Federal de Lavras.
Óleo essencial
Foi utilizado o óleo essencial de Origanum vulgare (Orégano), adquirido da Sigma Aldrich®.
Microrganismo, padronização e manutenção do inóculo
Para a realização do experimento foi utilizada a cepa de Escherichia coli Enterotoxigênica (ETEC) ATCC 35401, cedida pelo Laboratório de Enterobactérias, LABNET, Rio de Janeiro, RJ. A cultura estoque foi armazenada em meio de congelamento (glicerol, 15 mL; peptona bacteriológica, 0,5 g; extrato de levedura, 0,3 g; NaCl, 0,5 g e água destilada, 100 mL, pH 7,0). O inóculo foi reativado inoculando-se alíquotas de 100 µL das culturas estoque em tubos contendo 10 mL de caldo infusão cérebro de coração (BHI) e incubados, a 37 ºC, por 24 horas. A padronização do inóculo foi realizada mediante curva de crescimento. Após a reativação da cultura, alíquotas de 50 µL do inóculo foi transferida para 300 mL de caldo BHI e incubadas a 37 °C, sendo realizadas leituras periódicas da absorbância (600nm) em espectrofotômetro (BEL SP-2000) e plaqueamento em ágar triptona de soja (TSA) com incubação a 37 °C, por 24 horas. A cultura foi padronizada em, aproximadamente, 108 UFC mL-1.
Determinação da concentração mínima bactericida do óleo essencial de orégano sobre ETEC

A concentração mínima bactericida do óleo essencial foi determinada empregando-se a técnica de microdiluição em caldo, em placas de poliestireno de 96 cavidades, de acordo com o NCCLS (M7-A6) (NATIONAL COMMITTEE FOR CLINICAL LABORATORY STANDARDS – NCCLS, 2003) (15), com adaptações. O óleo essencial foi solubilizado em caldo BHI, acrescido de Tween 80 (0,5%). Foram avaliadas as seguintes concentrações (%): 2; 1; 0,5; 0,25; 0,125; 0,062; 0,03 e 0,015 (v / v). Alíquotas de 150 µL das soluções foram adicionadas nas cavidades e inoculados 10 µL das culturas padronizadas a, aproximadamente, 108 UFC mL-1. As microplacas foram vedadas e incubadas, a 37 ºC, por 24 horas. Após esse período, foi realizado o plaqueamento de alíquotas das culturas em TSA e incubadas, a 37 °C, 24 horas.
Foram utilizados dois controles para cada composto testado, o controle negativo, contendo BHI acrescido de 0,5% de Tween 80 e óleo essencial e o controle positivo, contendo BHI acrescido de 0,5% de Tween 80 e 10 µl de inóculo padronizado. Foi considerada a concentração mínima bactericida (CMB) do óleo essencial em que, após a incubação, não houve crescimento bacteriano em placas. O experimento foi realizado em triplicata e três repetições.
Adaptação de ETEC ao óleo essencial de orégano
As células de ETEC foram expostas a concentração subletal do óleo essencial de orégano. A dose subletal foi determinada com base nas CMB e foi equivalente a CMB/4 (16), com adaptações. Em tubos tipo Falcon contendo 18 mL de caldo BHI acrescido de 0,5% de Tween 80 foi adicionado o óleo essencial na concentração subletal. Após homogeneização, alíquotas de 2 mL de inóculo padronizado foram adicionadas ao meio e os tubos foram incubados, a 37 ºC, por 6 horas. Após esse período, a cultura foi centrifugada a 5.000 xg/5 min e as células adaptadas, lavadas três vezes com solução salina, ressuspendidas em caldo BHI e padronizada em torno de 108 UFC mL-1, para posterior utilização.
Avaliação da adaptação de ETEC ao óleo essencial de orégano
As células expostas a concentração subletal do óleo essencial foram ressuspendidas em caldo BHI e a cultura padronizada a 108 UFC mL-1 para posterior exposição às diferentes concentrações do mesmo óleo essencial (CMB/2; CMB; 1,2CMB; 1,4CMB; 1,6CMB; 1,8CMB e 2CMB) ao qual a cultura foi previamente exposta. Utilizaram-se microplacas de poliestireno de 96 cavidades, de acordo com o NCCLS (M7-A6) (NCCLS, 2003) (15), com adaptações. O óleo essencial foi solubilizado em caldo BHI, adicionado de Tween 80 (0,5%). Alíquotas de 150 µL das soluções foram adicionadas nas cavidades e inoculados 10 µL das culturas padronizadas. As microplacas foram incubadas, a 37 ºC, por 24 horas. Após esse período, retiraram-se alíquotas de 10 µL, sendo realizado o plaqueamento em TSA pela técnica de microgotas e incubação a 37 ºC, por 24 horas. As células de ETEC foram classificadas como capazes de se adaptarem quando foi detectado crescimento em placas após cultivo em presença do óleo essencial em concentrações maiores que a CMB. Paralelamente, realizou-se o mesmo procedimento com células de ETEC não expostas a dose subletal, possibilitando a comparação entre células expostas e não expostas, quanto à susceptibilidade aos componentes.

RESULTADOS E DISCUSSÃO
A CMB do óleo essencial de orégano sobre ETEC foi de 1,0%. A bactéria apresentou capacidade adaptativa por crescer na concentração de 2XCMB, ou seja, 2%. Concentração a qual era letal á sua sobrevivência. As condições em que os microrganismos são expostos durante o processamento de alimentos pode levar ao desenvolvimento de respostas adaptativas e desenvolvimento de tolerância após a exposição a fatores subletais de estresse, capazes de provocar danos às células microbianas (17). Essas alterações permitem aos microrganismos manterem seu metabolismo e, portanto, sobreviverem e se multiplicarem após exposição a condições de estresse em produtos alimentares. Também tem sido demonstrado que existe uma série de mecanismos moleculares que os microrganismos utilizam para se adaptar e sobreviver (18). Mudanças adaptativas a estresses ambientais exigem grandes quantidades de energia e durante as fases de adaptação todas as divisões celulares normais são interrompidas. Isso tem várias consequências importantes para as toxinfecções alimentares microbianas ou deterioração, como a fase de latência antes que o crescimento se estenda, as reduções das taxas de crescimento e os números celulares finais diminuem (19). Os requisitos nutricionais e composição enzimática e química das células são também afetados. Isso caracteriza a importância de se entender as respostas adaptativas que os microrganismos utilizam para sobreviver em ambientes antes letais.

CONCLUSÕES
Neste trabalho comprova-se o potencial do óleo essencial de orégano contra ETEC, sendo, portanto, útil na indústria de alimentos, desde que utilizado em concentrações corretas. ETEC desenvolveu capacidade adaptativa ao óleo essencial após exposta a dose subletal do mesmo, por tornar-se capaz de crescer em concentração de até 2x o valor da CMB, concentração esta que era letal a sobrevivência da célula.
AGRADECIMENTOS

Os autores agradecem o apoio da Universidade Federal de Lavras, da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior – Brasil (CAPES), do Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) e da Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas-Gerais (FAPEMIG).

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