Capítulo de livro publicado no Livro da IV Mostra dos Trabalhos de Conclusão de Curso da Especialização em Vigilância Laboratorial em Saúde Pública. Para acessa-lo clique aqui.

doi.org/10.53934/9786599965821-34

Este trabalho foi escrito por:

Gabriele Lopes Socossiuc¹; Erika Kushikawa Saeki²

¹Estudante do Curso de Especialização Vigilância Laboratorial em Saúde Pública do Centro de Laboratório Regional Instituto Adolfo Lutz de Presidente Prudente; E-mail: [email protected]

²Docente/Pesquisador Científico do Centro de Laboratório Regional Instituto Adolfo Lutz de Presidente Prudente.

Resumo: A qualidade da água fornecida para a população deve atender os requisitos da Portaria GM/MS Nº 888, de 04 de maio de 2021. O objetivo deste trabalho foi investigar a produção de motilidade Swarming, formação de biofilmes e avaliar o perfil de sensibilidade antimicrobiana em isolados de E. coli. Os 66 isolados testados foram obtidos do sistema de abastecimento público, águas de poços artesianos ou semi-artesianos e minas. O isolamento de E. coli foi realizado a partir do substrato cromogênico a 35 ºC/ 24 h com crescimento em ágar eosina azul de metileno a 37 ºC/ 24 h. Foram realizados os ensaios de motilidade Swarming, formação de biofilmes em placas de poliestireno e teste de sensibilidade antimicrobiana. Dos isolados testados, 46 (69,7%) foram obtidos de águas de abastecimento público, 17 (25,8%) de poços artesianos ou semi-artesianos e 3 (4,5%) de minas. Quanto à motilidade Swarming 58 (87,9%) foram fracamente móveis, sete (10,6%) moderadamente móveis e, um (1,5%) altamente móvel. Todos os isolados com motilidade Swarming moderado e alto foram obtidos do sistema de abastecimento público. Em relação à formação de biofilmes, três (4,5%) foram produtores fortes de biofilmes, dois (3,0%) moderados produtores, 50 (75,8%) fracos produtores e 11 (16,7%) não produtores. No teste de sensibilidade antimicrobiana, 13 (19,7%) apresentaram multirresistência. Os isolados com formação de biofilmes fortes e moderados apresentaram multirresistência antimicrobiana e foram obtidos de abastecimento público e poços. Destacamos o possível risco à Saúde Pública devido ao consumo de água proveniente do sistema de abastecimento público e poços contendo E. coli que apresentam alta motilidade Swarming, capacidade de formação de biofilmes e resistência a importantes antibióticos. Por isso, toda água para consumo humano deve apresentar um processo de desinfecção para garantir a qualidade da água a toda população.

Palavras-chave: biofilme, motilidade swarming, resistência antimicrobiana, qualidade da água

INTRODUÇÃO

A água é o componente mais abundante nos sistemas vivos, constituindo cerca de 70% do peso da maioria dos organismos. É considerada necessidade primordial para a vida e o recurso natural indispensável ao ser humano e aos ecossistemas (DA SILVA et al., 2019).

A qualidade da água que é fornecida para a população deve passar por um processo no qual haja controle e cuidado desde a captação até sua distribuição (SPECIAN et al., 2021), atendendo os requisitos estabelecidos na Portaria GM/MS nº 888, de 4 de maio de 2021 (BRASIL, 2021) responsável por estabelecer os procedimentos de vigilância, controle de qualidade e padrão de potabilidade da água para consumo humano, que define como critério microbiológico a ausência de Escherichia coli em 100 mL de água. (ODONKOR; ADDO, 2018; GURGEL et al., 2020).

Os parâmetros microbiológicos são características importantes da água para consumo humano, pois a presença de patógenos está diretamente ligada a doenças de veiculação hídrica, responsáveis pelas altas taxas de morbidade e mortalidade em todo o mundo (DA SILVA et al., 2019; GURGEL et al., 2020), o que a torna uma questão indispensável para a saúde pública (FRIAS et al., 2020).

Dentre os fatores de virulência de E. coli, destacam-se a capacidade de formação de biofilmes, relacionado com a resistência a antimicrobianos e a geração de infecções graves; a motilidade swarming através de flagelos; a presença de fímbrias; a formação de pili e a capacidade da bactéria em codificar antígenos capsulares K1 e K5 (COSTA et al., 2019).

O objetivo deste trabalho foi investigar a produção de fatores de virulência de Escherichia coli isoladas de amostras de água para consumo humano.

MATERIAL E MÉTODOS

Foram analisados 66 isolados de E. coli obtidos de águas do sistema de abastecimento público, águas de poços artesianos ou semi-artesianos e minas recebidos pelo CLR IAL Presidente Prudente através do Programa Proágua durante os anos de 2028 a 2020. O isolamento das bactérias foi realizado a partir da técnica de presença e ausência com o substrato cromogênico Colilert® (IDEXX, Brasil) a 35 ºC/ 24 horas, seguido de crescimento em ágar eosina azul de metileno (EMB) a 37 ºC/ 24 horas e confirmados pelo crescimento em meio Rugai com lisina a 37°C por 24 horas.

Para a realização do teste de motilidade Swarming, os isolados testados foram incubados em caldo Luria Bertani (LB) a 37°C por 24 horas, seguida por semeadura em ágar triptona de soja (TSA) a 37°C por 24 horas. Posteriormente, transferiu-se as colônias para um tubo contendo 3 mL de solução salina estéril 0,85 % para a obtenção da escala de McFarland 0,5 (concentração de 5×10⁸ UFC/mL). Suspendeu-se 10 μL do inóculo no centro do Ágar Swarming (glicose 1%, peptona 0,5%, extrato de levedura 0,2% e ágar 0,5%) em triplicata. A zona de motilidade (mm) foi medida após incubação a 37°C por 24 horas. As médias dos diâmetros dos halos formados foram calculadas e caracterizadas em: não móvel ou fracamente móvel d < 20mm; moderadamente móvel 20 mm ≤ d < 40 mm e altamente móvel d ≥ 40 mm (ABDOUCHAKOUR et al., 2018).

Os ensaios para a formação de biofilmes seguiram a metodologia proposta por Ramos-Vivas et al. (2019) com algumas adaptações. Primeiramente, cada cepa foi crescida em caldo LB a 37°C por 24 horas, seguida de semeadura em ágar TSA a 37°C por 24 horas. Realizou-se uma suspensão bacteriana em solução salina estéril 0,85 % para obter 0,5 da escala de McFarland. Em seguida, foi testada a produção de biofilmes em placas de microtitulação de polietileno com fundo chato de 96 poços por meio da coloração com cristal violeta. A leitura foi realizada em leitor de ELISA a 620 nm. Os isolados foram classificados em: não produtore de biofilmes (DO ≤ DOc); produtores fracos (DOc< DO ≤ 2x); produtores moderados (2x DOc< DO ≤ 4x) e produtores fortes (4x DOc< DO).

O teste de sensibilidade aos antimicrobianos e a interpretação foram realizados pela técnica da difusão do antimicrobiano em ágar Mueller-Hinton a 35°C por 24 horas, de acordo com o BRCast (2021;2022). A resistência antimicrobiana foi determinada de conforme descrito por Migiorakos et al. (2012).

Os antimicrobianos avaliados foram: Cefoxitina 30 µg (FOX); Cloranfenicol 30 µg (C); Sulfametoxazol-trimetoprim 25 µg (SXT); Levofloxacina 5 µg (LEV); Norfloxacina 10 µg (NOR); Amoxicilina-ácido clavulânico 30 µg (AMC); Cefepime 30 µg (FEP); Aztreonam 30 µg (ATM); Cefotaxima 5 µg (CTX); Ceftazidima 10 µg (CAZ); Ciprofloxacina 5 µg (CIP); Ertapenem 10 µg (ETP); Gentaminina 10 µg (CN); Imipenem 10 µg (IPM); Meropenem 10 µg (MEM); Piperacilina-tazobactam 36 µg (TZP); Tobramicina 10 µg (TOB); Amicacina 30 µg (AK); Ampicilina 10 µg (AMP) e Ampicilina- sulbactam 20 µg (SAM).

Os resultados foram avaliados em planilhas Excel (Microsoft Excel) e os gráficos elaborados em software GraphPad Prism 9 (GraphPad Software, Inc.).

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Quanto aos isolados de E. coli que foram testados, 46 (69,7%) foram obtidos de águas de abastecimento público, 17 (25,8%) obtidos de poços artesianos ou semi-artesianos e 3 (4,5%) de minas.

A bactéria E. coli possui uma capacidade de sobrevivência e crescimento em diversas condições ambientais, favorecida pela sua versatilidade metabólica e fisiológica, possuindo flagelos que permitem o seu deslocamento em ambientes líquidos, em especial nas águas para consumo humano. De acordo com Ruan et al. (2021), a motilidade é uma característica do patógeno necessária para o processo de colonização, adesão e potencialização da infecção.

Considerando a classificação apresentada por Abdouchakour et al. (2018), dos 66 isolados pesquisados, 58 (87,9%) foram consideradas fracamente móveis, 7 (10,6%) moderadamente móveis e, 1 (1,5%) altamente móvel, obtendo uma área de motilidade que variou de 07 a 62 mm (Gráfico 1).

Todos os isolados que apresentaram motilidade Swarming moderado e alto foram obtidos do sistema de abastecimento público.

A formação de biofilmes pela bactéria E. coli é um processo complexo que compreende a colonização, acumulação, maturação, descamação e replantação (RUAN et al., 2021), sendo mais favorável a formar biofilmes com maior intensidade quando encontradas em meio aquático (MACEDO et al., 2020).

Dos 66 isolados de Escherichia coli analisados, três (4,5%) foram considerados produtores fortes de biofilmes, dois (3%) produtores moderados, 50 (75,8%) produtores fracos, e 11 (16,7%) não produziram biofilmes (Tabela 1). Macedo et al. (2020) verificaram que 74,12% dos isolados de E.coli obtidos de águas in natura (minas e poços) apresentaram capacidade de formação de biofilmes.

Conforme apresentado por Guerra et al. (2006), a presença de biofilmes nas redes de distribuição formados a partir da matéria orgânica na água está relacionada com a demanda e uso de diferentes desinfetantes, que diferem em como agem nos microrganismos e influenciam na barreira de desinfecção. Enquanto que, os autores O’Toole; Kolter (1998) relataram que os fatores associados à superfície bacteriana, como os flagelos e pili tipo IV, são as estruturas essenciais para o processo de desenvolvimento dos biofilmes.

Dentre os três isolados fortes produtores de biofilme, todos apresentaram multirresistência no teste de sensibilidade antimicrobiana, sendo que dois isolados foram obtidos de poços e um do sistema de abastecimento público. Os dois isolados com produção moderada de biofilmes foram obtidos do sistema de abastecimento público, e também apresentaram multirresistência aos antibióticos testados.

Quanto ao perfil de sensibilidade aos antimicrobianos, CTX, CAZ, CIP e MEM, apresentaram eficiência de 100% sobre os isolados. Entretanto, os antibióticos FOX, AMC, CN, TOB e AMP indicaram 12 ou mais isolados resistentes (Gráfico 2).

De acordo com a classificação apresentada por Magiorakos et al. (2012), dos 66 isolados, 13 (19,69%) apresentaram multirresistência, sendo 7 de abastecimento público, 5 de poços e 1 de mina.

De acordo com Szekeres et al. (2017), os perfis de sensibilidade de E. coli em ambientes aquáticos são influenciados pela alta taxa de consumo de medicamentos sem prescrição médica, aos efluentes hospitalares sem tratamento adequado e às altas concentrações de resíduos de antibióticos lançados em diversos corpos d’água. Silva et al. (2022) destaca que a possibilidade de exposição de pessoas por bactérias resistentes durante a utilização de água para consumo fortalece a necessidade de estratégias de saúde, sanitárias e ambientais como melhoria do saneamento, com o objetivo de garantir a saúde da população.

CONCLUSÕES

Diante dos resultados apresentados destacamos o possível risco à saúde pública devido ao consumo de água proveniente do sistema de abastecimento público e poços contendo Escherichia coli que apresentam alta motilidade, capacidade de formação de biofilmes e resistência a importantes antibióticos. Especialmente, causa preocupação às águas de poços que são utilizadas para consumo humano sem tratamento prévio. Por isso, conforme a legislação vigente é importante que toda água para consumo humano passe por processo de desinfecção para garantir a qualidade da água a toda população.

REFERÊNCIAS

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BRASIL. Ministério da Saúde. Gabinete do Ministro. Portaria Nº 888, de 04 de maio de 2021. Altera o Anexo XX da Portaria de Consolidação GM/MS nº 5, de 28 de setembro de 2017, para dispor sobre os procedimentos de controle e de vigilância da qualidade da água para consumo humano e seu padrão de potabilidade.

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