Capítulo de livro publicado no Livro da IV Mostra dos Trabalhos de Conclusão de Curso da Especialização em Vigilância Laboratorial em Saúde Pública. Para acessa-lo clique aqui.

doi.org/10.53934/9786599965821-02

Este trabalho foi escrito por:

Gustavo Carvalho Amorim¹; Carlos Roberto Prudêncio²

¹Estudante do Curso de Especialização em Vigilância Laboratorial em Saúde Pública – Centro de Imunologia – Instituto Adolfo Lutz; E-mail: [email protected] ²Docente/pesquisador do Centro de Imunologia – Instituto Adolfo Lutz.

Resumo: A pandemia da COVID-19 trouxe inúmeros desafios para a sua mitigação ao redor do globo. A tecnologia de imunoprecipitação de fagos seguida pelo sequenciamento de alto rendimento (PhIP-Seq) propõe analisar o histórico imunológico individual e estudar interações antígeno-anticorpo por meio de fagos que expressam proteínas e peptídeos de interesse. Esse trabalho tem por objetivo otimizar e padronizar a técnica de titulação e expansão de uma biblioteca de antígenos de coronavírus expressos em fagos T7 (CoronaScan), bem como a quantificação de imunoglobulinas IgG (IgG) de amostras em soro humano por ELISA, que, combinadas, permitirão o aprimoramento de análises e estudos imunológicos e epidemiológicos. A cepa E. coli BLT5403 foi usada como hospedeira nos ensaios de titulação e expansão da biblioteca CoronaScan em placas ágar LB. Para a quantificação de IgG, uma curva padrão foi construída a partir de uma solução de IgG purificada e com concentração conhecida, juntamente a determinação de IgG de uma amostra de soro, que deverá ser utilizado como controle nos futuros ensaios. Após a expansão, biblioteca CoronaScan (1,5×10⁵ ± 0,7 pfu/mL) passou a ter a titulação de 1,5×10¹⁰ ± 2,12 pfu/mL, enquanto a concentração de IgG adequado para o método se encontrou na diluição de 1/1.000.000. Apesar da otimização e a da padronização de tais técnicas terem sido realizadas, novos ensaios de quantificação de IgG pelo método de ELISA serão necessários para assegurar a reprodutibilidade. Além disso, recomenda-se a realização do controle da qualidade da biblioteca CoronaScan a fim de analisar a sua diversidade de peptídeos.

Palavras–chave: coronavírus; PhIP-Seq; T7; vigilância epidemiológica

INTRODUÇÃO

A pandemia da COVID-19 (Coronavirus disease 2019), doença causada pelo vírus SARS-CoV-2 (do inglês severe acute respiratory syndrome coronavirus 2), requereu um grande esforço mundial para o controle de sua disseminação. Em dezembro de 2022, dados da Organização Mundial da Saúde (OMS) confirmaram um pouco mais de 630 milhões de casos e 6,6 milhões de mortes ocasionados pela doença, que foi identificada pela primeira vez na cidade de Wuhan, na China (Herstein et al., 2021; Peng et al., 2021; Rahman et al., 2021).

Mutações aleatórias nas proteínas estruturais spike e do nucleocapsídeo podem não somente dificultar o diagnóstico como também abalar as estratégias da vigilância epidemiológica já instauradas. A tecnologia de imunoprecipitação de fagos seguida pelo sequenciamento de alto rendimento (NGS) (PhIP-Seq, do inglês Phage

Immunoprecipitation Sequencing) é uma ferramenta poderosa capaz de investigar respostas do sistema imune provocadas por infecções virais, doenças imunes e infecciosas que podem comprometer o sistema imunológico. A técnica, ao ser combinada com a biblioteca de fagos T7 coronavírus VirScan (CoronaScan) – que representa os peptídeos dos coronavírus humanos endêmicos (HCoV-NL63, HCoV-229E, HCoV-OC43 e HCoVHKU1), SARS- CoV-1, SARS-CoV-2 e MERS (Middle East Respiratory Syndrome), além dos peptídeos de coronavírus encontrados em morcegos (BatCoV-Rp3, BatCov-HKU3 e BatCov-279) -, permite a identificação de peptídeos reconhecidos por imunoglobulinas IgG (IgG) por meio da imunoprecipitação mediada por esferas magnéticas sensibilizadas com proteínas A e G, com posterior amplificação das sequências codificantes por reação em cadeia da polimerase (PCR) e sequenciamento de nova geração (NGS) (Mohan et al., 2018; Morgenlander et al., 2021; Wiegand et al., 2022; Xu et al., 2015).

A biblioteca de fagos tem como base o phage display desenvolvido a partir de fagos T7, que apresenta vantagens frente ao fago M13, como maior estabilidade na presença de inserto, alta taxa de replicação em Escherichia coli, resistência a condições extremas e entre outras. (Deng et al., 2018; Krumpe & Mori, 2014; Tan et al., 2016; Yue et al., 2022).

Portanto, este trabalho tem como objetivo a otimização e padronização a titulação e expansão da biblioteca de fagos CoronaScan, e a padronização do ensaio de ELISA para a quantificação de IgG presentes no soro dos pacientes que serão utilizados nos experimentos de imunoprecipitação com a biblioteca.

MATERIAL E MÉTODOS

Os ensaios foram realizados de acordo com os protocolos descritos no Manual T7Select® System da Novagen (2011) e por Mohan e colaboradores (2018). Os resultados foram expressos como média e desvio-padrão (±) de pelo menos dois ensaios independentes. A titulação requereu E. coli BLT5403 com OD600 = 1,0 u.a. cultivada em meio

M9LB (NOVAGEN, 2011). As bactérias foram crescidas neste meio suplementado com x (concentração) ampicilina a 37° C sob agitação constante de 200 RPM. As células hospedeiras foram incubadas por 8 min com 100 µL da biblioteca CoronaScan previamente diluída em meio LB nas diluições de 10² a 10⁹. Em seguida, 3 mL de meio top agarose (20 g de meio LB e 0,6 de agarose low melting em volume final de 1 L) foi adicionado para cada diluição, sendo essa mistura plaqueada sob uma camada de LB ágar com ampicilina a 50 µg/mL em uma superfície plana e incubada overnight a temperatura ambiente (TA). A titulação (pfu/mL) foi determinada por meio da contagem das unidades formadoras de placas (pfu) na placa LB contendo a maior diluição em que as placas de fagos puderam ser contadas de modo isolado. A estimativa da concentração da biblioteca foi auxiliada por meio da seguinte fórmula: Titulação (pfu/mL) = PFU × Fator de diluição × 10.

Para a realização da expansão da biblioteca CoronaScan, foi necessitado uma concentração de 1×10⁶ de fagos para cada 10 mL das células hospedeiras com OD600 = 0,6 a 1,0 u.a. Foi separado, em diferentes tubos, 1 mL da mistura fagos/hospedeiro e adicionado 10 mL de meio top agarose aquecido a 45° C, sendo plaqueada em placas de Petri contendo

uma camada de ágar LB com ampicilina a 50 µg/mL, seguido pela incubação em TA em uma superfície plana overnight. Após a conferência da quase confluência da placa, 10 mL do tampão de extração (20 mM Tris-HCl pH 8.0, 100 mM NaCl e 6 mM MgSO4) foi adicionado e as placas foram incubadas a 4° C em uma superfície plana overnight. Assim, o tampão de extração foi transferido para um único tubo estéril e 500 µL de clorofórmio foi adicionado para uma centrifugação de 3000 g por 5 minutos, sendo a nova titulação conferida após o término. A biblioteca foi aliquotada e armazenada a -80° C em DMSO 10% (vol/vol).

A quantificação de IgG foi realizada por um ELISA sanduíche, onde uma placa de 96 poços foi adsorvida com 2 µg/mL da porção Fab de anti-IgG humana (SouthernBiotech^®, Birmingham, Alabama, EUA), produzido em cabra, diluído em tampão carbonato- bicarbonato (pH 9.5) em volume final de 50 µL/poço. A placa foi selada e incubada overnight a 4ºC e, então, o anticorpo de captura não adsorvido foi descartado. Logo, a placa foi lavada com tampão de lavagem (PBS 0,05% Tween-20) e bloqueada com solução de bloqueio (PBS 5% leite desnatado Molico^®, Vevey, Suíça) por 1 hora a 37° C. A placa foi lavada novamente e 50 µL/poço da solução padrão de IgG (Human IgG Normal, Invitrogen^®, Waltham, Massachusetts, EUA) diluída em solução de bloqueio foi adicionada em duplicata nas concentrações de 200, 100, 33.33, 11.11, 3.7, 1.23 e 0.41 ng/mL. Concomitantemente, um soro pertencente ao banco de soros do Laboratório de Imunobiotecnologia do Instituto Adolfo Lutz (autorizada, sob o n° 32264120.5.2001.0061, no Comitê de Ética do Instituto de Infectologia Emílio Ribas) foi diluído em solução bloqueio nas razões de 1/10.000, 1/100.000, 1/400.000, 1/800.000, 1/1.000.000, 1/2.000.000, 1/4.000.000 e 1/8.000.000 e

adicionada à placa em duplicata em volume de 50 µL/poço, sendo a placa selada e incubada por 1 hora a 37° C. Em seguida, a placa foi lavada 5x para remoção do material não ligado. Posteriormente, foi feita a incubação com 50 µL/poço de uma solução de anticorpo anti- human IgG -HRP (1:5000) em TA por 30 min. Após a lavagem, 50 µL/poço do substrato TMB (3,3′,5,5′-tetrametilbenzidina) foi adicionado em TA e a placa foi coberta em papel alumínio, sendo a intensidade de coloração monitorada a cada 2 minutos. A solução de (0,2 N de H2SO4) foi adicionada seguindo a ordem de adição de TMB (50 µL/poço). Por fim, a absorbância da placa foi lida no comprimento de onda (λ) de 450 nm. Os dados obtidos foram analisados no software GraphPrism versão 8.0.1 (GraphPad Software, San Diego, Califórnia EUA). A concentração da amostra de soro foi determinada pela interpolação dos valores de absorbância obtidos na diluição 1/1.000.000 com a curva padrão pelo modelo “sigmoidal, 4 PL and X is logX (concentration)”, sendo a curva padrão da amostra de soro construída por meio da análise de regressão não-linear pelo modelo “one-site binding model”.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Inicialmente, a biblioteca CoronaScan, que já se encontrava em posse do Laboratório de Imunobiotecnologia do IAL, obteve uma média de titulação (realizada em duplicata) de 1,5×10⁵ (± 0,7) pfu/mL, como demonstrado na tabela 1.

O processo morfogênico do fago T7 garante a expressão de uma maior diversidade de aminoácidos quando comparado ao fago M13, acarretando um maior número de peptídeos funcionais, a depender do quanto a nova molécula pode interferir na instabilidade da partícula viral bem como impedir a replicação do mesmo (Krumpe et al., 2007).

O método de escolha para a amplificação da biblioteca foi por ensaio de lise em placa, uma vez que o total de recombinantes primários era inferior a 5×10⁶ pfu/mL, como demanda o protocolo da Novagen T7Select® System Manual (NOVAGEN, 2011). Após a expansão, foi possível observar pela grande confluência das placas utilizadas no procedimento que a titulação havia aumentado. Após a realização de uma nova titulação, determinou-se que a biblioteca foi aumentada cerca de 100.000 vezes, estando estimada em um título de 1,5×10¹⁰ (± 2,12) pfu/mL, conforme observado na tabela 2.

Embora o título da biblioteca tenha aumentado consideravelmente, é preocupante a qualidade da biblioteca, no que se diz a respeito à diversidade viral em que ela representa. O sequenciamento de Sanger e o NGS são duas alternativas que podem auxiliar na análise representativa dos fagos ali presentes. O sequenciamento de Sanger possibilita a investigação acerca da capacidade de síntese de oligonucleotídeos dos fagos, sendo limitado a 10³ sequências, enquanto o NGS permite identificar a distribuição da frequência clonal da biblioteca e de sua integridade em uma janela de 10⁶ a 10⁸ ligantes, o que minimiza a subestimação da população de fagos e, consequentemente, na qualidade geral da biblioteca. Além disso, mutações e proteínas truncadas são características conhecidas por alterar a cinética de crescimento dos fagos que as apresentam, levando à proliferação vantajosa frente aos demais (Matochko & Derda, 2015; Mohan et al., 2018).

O PhIP-Seq exige, ao menos, 1 µL de soro por paciente, uma vez que apenas 2 µg de IgG para a técnica de imunoprecipitação é requisitado. Jollift e colaboradores (1982) observaram por nefelometria que os valores de referência de IgG em adultos permeiam entre 6,39 a 13,49 g/L, em uma média de 9,94 g/L. A curva padrão foi construída com os valores da concentração de IgG padrão conhecida e transformados em valores de logaritmo na base

10. A interpolação das amostras à curva padrão se mostrou ter um ajuste adequado para a curva (R²=0,99) de acordo com o software GraphPad. Assim sendo, a diluição do soro na razão de 1/1.000.000 recomendada por Mohan et al. (2018) foi adequada para a obtenção de 9 mg/mL de IgG a partir da amostra de soro, ambas as curvas podem ser observadas na figura 3.

Ao utilizarem a biblioteca VirScan, uma biblioteca similar que engloba todo o viroma humano, Xu et al. (2015) constataram uma sensibilidade e especificidade de 95% quando testada e comparada para o vírus da imunodeficiência humana (HIV) e vírus da hepatite C (HCV) e seus respectivos ensaios de ELISA, assim como em teste sorológico para Herpes Simplex Virus tipo 1 (HSV-1) e tipo 2 (HSV-2), possibilitando a avaliação desses parâmetros para os vírus dos mais diversos tamanhos. Shrock e colaboradores e (2020) com a mesma técnica, descreveram uma sensibilidade de 99% e especificidade de

98% para um modelo computacional capaz de identificar a exposição contra o SARS-CoV2. Chen e colaboradores (2022) descreveram um modelo computacional, BEER, capaz de aumentar a sensibilidade de peptídeos fracamente reativos para o uso do PhIP-Seq.

Os mecanismos que desencadeiam sequelas pós-agudas do SARS-CoV-2 (PASC, do inglês Post-Acute Sequelae of SARS-CoV-2) ainda não estão muito bem esclarecidos. Uma saída para elucidar os biomarcadores que conduzem a essa condição é o uso da tecnologia PhiP-Seq, que pode ser relevante para a obtenção de respostas e questionamentos científicos, principalmente dentro do âmbito de estudos epidemiológicos de soroprevalênca (Mantovani et al., 2022).

CONCLUSÕES

Com a otimização da titulação e da expansão da biblioteca CoronaScan, a manutenção, isso é, a constante renovação da biblioteca, poderá ser feita ao longo do tempo a medida em que os ensaios de PhIP-Seq forem sendo realizados, se tornando uma fonte inesgotável de reagente. No entanto, a quantificação de IgG pelo método de ELISA ainda precisa ser aprimorada para assegurar a reprodutibilidade em amostras de soro de pacientes de diferentes quadros clínicos. Sobretudo, recomenda-se a realização do controle de qualidade de biblioteca, devido ao fato da mesma ter sido expandida a partir de um estoque cuja titulação era abaixo do valor esperado.

AGRADECIMENTOS

Aos meus colegas de laboratório de Imunobiotecnologia, que contribuíram imensamente para a construção desse trabalho e para a minha formação e a coordenadoria e professores do Curso de Especialização em Vigilância Laboratorial em Saúde Pública do Instituto Adolfo Lutz, com os quais tornaram esse projeto possível.

REFERÊNCIAS
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