Capítulo de livro publicado no Livro da IV Mostra dos Trabalhos de Conclusão de Curso da Especialização em Vigilância Laboratorial em Saúde Pública. Para acessa-lo clique aqui.

doi.org/10.53934/9786599965821-23

Este trabalho foi escrito por:

Tamires Dantas Campos¹; Vanessa Nieri Zanelatto²

¹Estudante do Curso de Vigilância Laboratorial e Epidemiologia – NCMO – CEFOR; E-mail: [email protected]

²Docente/pesquisadora do Núcleo de Coleção de Micro-organismos – NCMO; E-mail: [email protected]

Resumo: As coleções de micro-organismos atuam armazenando, conservando e fornecendo linhagens de importância para pesquisas em diversas áreas da saúde, meio ambiente, indústrias e controle de qualidade. Também faz parte do trabalho das coleções caracterizar e autenticar as linhagens, conferindo maior confiança e especificidade ao material fornecido. A Coleção de Culturas do Instituto Adolfo Lutz armazena e organiza cepas de grande importância para a saúde pública e pesquisas. Para realizar a autenticação do material depositado, são utilizadas técnicas de identificação fenotípica e métodos de biologia molecular. O presente trabalho teve como objetivo caracterizar e autenticar linhagens de bactérias Gram-positivas armazenadas pelo método de liofilização no Núcleo de Coleção de Micro-organismos (NCMO) do Instituto Adolfo Lutz por meio de identificações fenotípicas, espectrometria de massas (MALDI-TOF) e sequenciamento genético. Foram selecionadas linhagens dos gêneros Corynebacterium, Staphylococcus, Streptococcus e Rhodococcus, que passaram por identificação. Foi possível diferenciar as espécies dos gêneros Corynebacterium por todos os métodos usados, confirmando resultados através de sequenciamento Sanger, não conseguindo distinguir apenas seus biovares. Todas as espécies de Staphylococcus foram estabelecidas pelas técnicas tradicionais de identificação. As linhagens de Streptococcus foram classificadas como pertencentes ao grupo viridans pelas técnicas tradicionais, sendo sua espécie determinada por espectrometria de massas e sequenciamento. As linhagens de Rhodococcus equi foram identificadas por espectrometria de massas. Diante dos resultados obtidos, foi possível concluir que a metodologia do MALDI-TOF foi a mais eficiente na autenticação das linhagens estudadas e que os métodos utilizados no NCMO são eficazes na preservação das características originais dos micro- organismos.

Palavras-chave: Coleções de culturas, Corynebacterium, Rhodococcus, Staphylococcus, Streptococcus.

INTRODUÇÃO

As coleções de cultura são Centros de Recursos Biológicos (BRC), que armazenam materiais biológicos autenticados, identificados com alta precisão, servindo como repositórios da biodiversidade e centros de recursos microbianos. Estes centros possuem experiência em preservar, cultivar, caracterizar e distribuir linhagens autenticadas, fornecendo recursos para ensaios de controle de qualidade, inovação e pesquisas (JANSSENS, D. et al, 2010; BECKER, P. et al, 2019).

O Núcleo de Coleção de Micro-organismos (NCMO) do Instituto Adolfo Lutz, membro da Word Federal for Culture Collections (WFCC) é classificado como uma coleção de serviços, com acervo abrangente, com curadoria profissional e importante papel na caracterização, manutenção e distribuição de micro-organismos, desde 1940 (ANDRADE, T. S., 2008).

O acervo do NCMO é constituído por aproximadamente 10 mil linhagens, desta forma, para mantê-lo atualizado são necessárias revisões constantes, sendo necessário emprego de técnicas modernas para contribuir com este processo. Assim, o presente trabalho teve como objetivo caracterizar e autenticar bactérias Gram-positivas, presentes na coleção do Instituto Adolfo Lutz, utilizando técnicas tradicionais e modernas, tornando-as disponíveis para fornecimento. Para isso foram selecionadas linhagens dos gêneros Corynebacterium, Rhodococcus, Staphylococcus e Streptococcus, micro-organismos considerados de importância para saúde pública e relacionados a infecções em pacientes imunocomprometidos.

MATERIAL E MÉTODOS

Para este trabalho foram selecionados micro-organismos liofilizados depositados no acervo da coleção, a partir do acrônimo IAL, Tabela 1.

Para realizar a autenticação foram utilizados os seguintes métodos:

• Análise macroscópica, analisando a uniformidade do crescimento em meio de cultura, e microscópica, usando coloração de Gram e de Albert-Laybourn (identificando grânulos metacromáticos em bacilos corineformes) e microscópio óptico com aumento de 1000X;
• Identificação fenotípica por meio de provas bioquímicas, diferenciando espécies a partir das transformações químicas num determinado substrato, e antibiograma, avaliando a suscetibilidade a antimicrobianos, sendo necessário, para esta técnica, a produção de suspensão bacteriana com turbidez equivalente a escala 0,5 de McFarland e o uso de discos de Novobiocina (5 µg) ou Optoquina (5 mcg);

• MALDI-TOF (Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization – Time of Flight Mass Spectrometry) identificando a presença de proteínas específicas através da dessorção de moléculas a laser, sendo estas aspiradas a vácuo até um detector, que avalia seu tempo de chegada, produzindo um gráfico, com picos proteicos, analisado e interpretado de forma computadorizada. Para identificação de bactérias Gram-positivas foi realizada extração proteica em tubo (usando etanol 100%, ácido fórmico 70% e acetonitrila) e extração direta (usando ácido fórmico 95%), comparando os resultados obtidos com os presentes na biblioteca padrão do equipamento Bruker, sendo os que apresentaram score entre 2,00 – 3,00, considerados de alta confiança.
• Sequenciamento genético pelo método Sanger analisando a sequência do gene codificador do RNA ribossomal da porção 16S, onde existem regiões de consenso, variabilidade e hipervariabilidade, que permitem identificar diferentes espécies. Para este trabalho foi realizada a extração de material genético; amplificação utilizando os primers 27F/518R. Confirmada amplificação e integridade, foi realizada a purificação dos produtos com o MEGAquick-spin™ Total Fragment DNA Purification, quantificação em nanoespectrofotômetro, seguindo com a reação de sequenciamento usando o kit BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing e encaminhando a placa ao Laboratório Estratégico para ser analisada no equipamento 3500 Genetic Analyzer (Thermo Fisher).

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Análises Macroscópica e Microscópica

• Corynebacterium spp

Em macroscopia foram realizadas as seguintes observações:

• IAL 93 (C. diphtheriae) – crescimento em 48 horas, com coloração creme, aspecto cremoso, colônias pequenas, bem delimitadas e bordas uniformes;
  • IAL 99 (C. diphtheriae bv. gravis) e IAL 101 (C. diphtheriae bv. mitis) crescimento em 48 horas com coloração creme, aspecto cremoso, colônias medianas, bem delimitadas e bordas uniformes;
  • IAL 104 (C. pseudodiphtheriticum) – crescimento em 48 horas, com coloração creme, aspecto cremoso, colônias medianas, bordas pregueadas e centro branco;
  • IAL 1817 (C. glutamicum) – crescimento em 24 horas, com coloração creme, aspecto cremoso, colônias pequenas, bordas bem delimitadas e uniformes.

Em microscopia, as linhagens IAL 93, 99, 101 foram visualizados bacilos roxos, paliçados, com grânulos metacromáticos, confirmados pela coloração de Albert-Laybourn. As linhagens IAL 104 e 1817 apresentaram bacilos de coloração roxa, mais curtos que os anteriores, paliçados, sem grânulos metacromáticos, confirmado pela coloração de Albert- Laybourn. Desta forma, pode-se dizer que todas as linhagens estavam de acordo com a literatura de referência (WITHMAN, W. B., 2012).

• Rhodococcus equi

Em macroscopia observou-se que todas as colônias cresceram da mesma forma, visto que todas as linhagens pertenciam a mesma espécie; assim, nas primeiras 24 horas de crescimento, apresentaram coloração creme, aspecto cremoso e formação de colônias isoladas; com 48 horas, o crescimento apresentou coloração alaranjada, aspecto mucoide e brilhante, formando colônias com forma de “gota de lágrima” e bordas lisas.

Em microscopia óptica foi possível visualizar a alteração morfológica decorrente do ciclo celular da espécie. Com menos de 24 horas, foram observados bacilos Gram-positivos; após 24 horas, foram visualizados cocos Gram-positivos, permitindo dizer que as linhagens estavam de acordo com relatos literários (WITHMAN, W. B. et al, 2012).

• Staphylococcus spp

Em macroscopia observou-se que todas as linhagens (IAL 1598, 1603, 1604, 2012), apresentaram crescimento abundante em 24 horas, com coloração amarelada, aspecto cremoso e colônias pequenas. Em ágar sangue, o padrão de crescimento se repetiu, porém a cepa com IAL 2012 apresentou formação halo de β – hemólise, que pode se formar nesta espécie (ANVISA, 2008). Em microscopia óptica, foram observados cocos Gram-positivos, que se distribuíam pela lâmina em diplococos, arranjos lineares e arranjos semelhantes a “cachos de uva”. Os crescimentos e as características microscópicas encontradas estavam de acordo com a literatura (WITHMAN, W. B. et al., 2009).

• Streptococcus spp

Em macroscopia foram observados crescimento em 24 horas, das linhagens IAL 1828 e 1832, em jarra de anaerobiose, com formação de zonas de α – hemólise, formando um halo esverdeado ao redor das colônias brilhantes, com aspecto seco, tamanho pequeno e bordas delimitadas. Em microscopia foram observados cocos Gram-positivos dispostos aos pares ou em alinhamento, sendo que os cocos da linhagem IAL 1828 foram considerados maiores quando comparados aos da linhagem IAL 1832. Desta forma, pode-se afirmar que para as linhagens desse gênero, as características observadas foram compatíveis com as descritas na literatura (WITHMAN, W. B. et al., 2009).

Análises Bioquímicas

• Corynebacterium spp

Para as diferentes linhagens com diferentes identificações de espécie foram realizadas provas de catalase, redução de nitrito a nitrato, consumo de glicose, sacarose e trealose, além de redução de telurito. Os resultados obtidos foram comparados com a literatura de referência (WITHMAN, W. B, 2012), permitindo concluir que as linhagens de IAL 93, 99, 101 e 104 não apresentaram divergências em relação ao que se era esperado. A linhagem IAL 1817 não apresentou consumo de trealose, divergindo da literatura.

• Rhodococcus equi

Para as diferentes linhagens da espécie trabalhada foram realizadas provas de catalase, produção de indol, consumo de lactose, glicose, manitol e xilose, descarboxilação de lisina, ornitina, arginina e degradação da ureia. Os resultados obtidos foram comparados com a literatura de referência (PRESCOTT, J. F., 1991), permitindo concluir que as linhagens IAL 1997, 2043, 2052 e 2106 não apresentaram divergências, porém, existem relatos em desacordo sobre o consumo de glicose para a espécie (SILVA, P. et al., 2010). A linhagem IAL 2042 não apresentou degradação da ureia, divergindo das outras linhagens, porém nem todas as linhagens degradam este substrato (SILVA, P. et al., 2010).

• Staphylococcus spp

Para as diferentes linhagens deste gênero foram realizadas provas de catalase, coagulação de plasma, consumo de manitol, degradação de ureia, despolimerização de DNA, além de antibiograma com Novobiocina (5µg). Os resultados obtidos foram comparados a literatura de referência (ANVISA, 2008), permitindo concluir que todas as linhagens pertenciam a espécie S. aureus.

• Streptococcus spp

Para as diferentes linhagens deste gênero foram realizadas provas de catalase, hidrólise de esculina e detecção de α-hemólise, além de antibiograma com Optoquina (5mcg). Os resultados obtidos foram comparados com a literatura de referência (ANVISA, 2008), permitindo concluir que as espécies trabalhadas pertenciam ao grupo viridans, não permitindo afirmar a espécie das linhagens.

MALDI-TOF

As diferentes espécies de Corynebacterium, Staphylococcus e Streptococcus foram identificadas por extração direta do crescimento, enquanto as diferentes cepas de Rhodococcus equi apresentaram melhor identificação usando extração proteica. A técnica permitiu a identificação de todas as espécies do gênero Corynebacterium, porém não identificou os biovares das espécies C. diphtheriae trabalhadas.

As linhagens de Rhodococcus equi foram a identificadas com nomenclatura de Rhodococcus hoagii, identificação explicada pela semelhança, considerada controversa, constatada entre as espécies de Rhodococcus equi e Corynebacterium hoagii (VÀZQUEZ- BOLAND, J. A., SCORTTI, M., MEIJER, W., 2020).

Todas as linhagens do gênero Staphylococcus foram confirmadas como da espécie S. aureus. No caso das diferentes espécies de Streptococcus, a técnica identificou a linhagem IAL 1832 como S. sanguinis, porém, a linhagem IAL 1828 teve resultado inconclusivo, pois houve identificação de duas espécies, S. mitis e S. pneumoniae, sendo possível descartar a segunda espécie pelo cultivo em ágar bile esculina, que foi negativo, diferindo do esperado para esta espécie (ANVISA, 2008).

Identificação por Sequenciamento Genético

Com base nos resultados obtidos nas técnicas de diferenciação descritas anteriormente, foram selecionadas como para identificação por sequenciamento genético as linhagens de Corynebacterium, visando diferenciar os biovares das linhagens IAL 99 e 101, e as linhagens de Streptococcus, visando confirmar suas espécies, visto que por pertencerem ao mesmo grupo de Estreptococos (viridans).

Os resultados obtidos permitem dizer que as bactérias Gram-positivas extraídas por kit apresentaram resultados melhores. Além disso, pode-se dizer que a identificação com os primers 27F/518R foi mais eficiente, visto que houve formação de leituras consensuais.

A partir do sequenciamento, foi possível dizer que as espécies do gênero Streptococcus foram identificadas como S. mitis (IAL 1828) e S. sanguinis (IAL 1832), com similaridades de 99,7% e 100%, respectivamente. As linhagens de Corynebacterium tiveram suas espécies identificadas, confirmando os resultados de outras técnicas, porém, não foi possível identificar os biovares das linhagens IAL 99 e 101, possivelmente pelos primers utilizados não abrangerem trechos do genoma que possibilitem isso.

As espécies de Corynebacterium identificadas e suas respectivas similaridades foram: C. diphtheriae (IAL 93) – 99,13%; C. diphtheriae (IAL 99) – 99,1%; C. diphtheriae (IAL 101) – 99,77%; C. pseudodiphtheriticum (IAL 104) – 98,19%; C. glutamicum (IAL 1817) – 100%.

CONCLUSÕES

As linhagens de Corynebacterium foram identificadas por meio das técnicas morfológicas, fenotípicas, MALDI-TOF e por sequenciamento genético, porém nenhuma das técnicas permitiu determinar seus biovares, sendo necessários mais estudos. As linhagens de Rhodococcus equi tiveram suas espécies confirmadas por meio das técnicas de identificação morfológica e por MALDI-TOF, porém a identificação por técnicas fenotípicas não foi conclusiva por esta espécie ser reativa ao uso de técnicas bioquímicas.

Com os resultados obtidos para as linhagens de Staphylococcus spp foi possível determinar a espécie por técnicas de identificação morfológica, fenotípicas e MALDI-TOF, permitindo autenticar a linhagem IAL 1598. As linhagens de Streptococcus spp tiveram seu gênero e grupo de classificação determinado como viridans por identificação fenotípica e morfológica, porém as suas espécies só foram confirmadas com a identificação por MALDI- TOF e sequenciamento genético.

Assim, verificou-se que os métodos de identificação utilizados foram eficientes para as bactérias Gram-positivas estudadas neste trabalho, sendo que a identificação por MALDI- TOF se destacou como a mais assertiva nos diferentes gêneros trabalhados. Também foi possível verificar que o método de liofilização empregado para a manutenção das linhagens foi eficaz, uma vez que a maioria das características informadas na época do depósito corresponderam as análises realizadas neste trabalho, após muitos anos de preservação.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

ANDRADE, T. S. Seção de coleção de culturas do Instituto Adolfo Lutz – 68 anos de história dedicados à saúde pública. Boletim Epidemiológico Paulista, São Paulo, nov. 2008.

ANVISA. Módulo 4 – Gram-positivos. Disponível em <https://www.anvisa.gov.br/servicosaude/controle/rede_rm/cursos/boas_praticas/modulo4/ imp_stre4.htm>. Acesso em 14 de outubro de 2022.

BECKER, P. et al. Public microbial resource centers: key hubs for Findable, Accessible, Interoperable and Reusable (FAIR) microorganisms and genetic materials. Disponível em: <https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/31471301/>. Acesso em 17 de outubro de 2022.

JANSSENS, D., et al. The role of public biological resource centers in providing a basic infrastructure for microbial research. Disponível em: <https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/20399265/>. Acesso em 17 de outubro de 2022.

MACHADO, J. B. A. Uso da biblioteca genômica RNAr 16S como ferramenta para o estudo da microbiota fecal humana. Disponível em <https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/9/9136/tde-16012014-140900/pt-br.php>. Acesso em 18 de novembro de 2022.

PRESCOTT, J. F. Rhodococcus equi: an animal and human pathogen. Clinical Microbiology Reviews. Vol. 4, 1991. P. 20 – 34. Disponível em < https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC358176/pdf/cmr00042-0036.pdf>. Acesso em 14 de novembro de 2022.

SILVA, P. et al. Rhodococcus equi isolation from sputum of patients with suspected tuberculosis. Disponível em <https://www.scielo.br/j/mioc/a/yT9zSjHLzC9tbDL5L3cX4Mz/?lang=en&format=html>. Acesso em 16 de novembro de 2022.

VÀZQUEZ-BOLAND, J. A., SCORTTI, M., MEIJER, W. Conservation of Rhodococcus equi (Magnusson 1923) Goodfellow and Alderson 1997 and rejection of Rhodococcus hoagii (Morse 1912) Kämpfer et al. 2014. International journal of systematic and evolutionary microbiology, 2020. Disponível em < https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/32375930/>. Acesso em 14 de outubro de 2022.

WITHMAN, W. B. Bergey’s Manual of Systematics of Archaea and Bacteria. First Edition. 2012.

WITHMAN, W. B. et al. Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology. Second Edition. Volume Three – The Firmicutes. 2009.

WITHMAN, W. B. et al. Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology. Second Edition. Volume Five – The Actinobacteria, Part A. 2012.