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Este trabalho foi escrito por:

Givaldo Gabriel Alves da Silva ^*; Gisele Nayara Bezerra da Silva ; Rosângela Estevão Alves Falcão ; Vladimir da Mota Silveira Filho

*Autor correspondente (Corresponding author) – Email: [email protected]

Resumo: Os radicais livres são moléculas reativas e instáveis provenientes de reações metabólicas, em que seu excesso contribui para o desenvolvimento do estresse oxidativo, podendo intensificar patologias cardiovasculares, neurodegenerativas e carcinogênicos. Os antioxidantes agem no combate contra esses radicais livres, fazendo com que essas moléculas reativas, sejam neutralizadas. Terapias utilizando antioxidantes naturais têm se tornado relevantes devido a sua baixa toxicidade. Este trabalho buscou avaliar a capacidade antioxidante do cajueiro (Anacardium occidentale) e do umbuzeiro (Spondias tuberosa). Para isso, foram analisados diferentes extratos etanólicos destas plantas: casca e folha do cajueiro (CC e CF) e casca e fruto do umbuzeiro (UC e UF). Os extratos foram submetidos ao teste de captura de radicais livres (ABTS+), avaliação da atividade hemolítica e ensaio de proteção ao DNA frente a um agente oxidante. Foi observado que todos os extratos possuem uma atividade sequestradora de elétrons acima de 70% nas concentrações testadas. Além disso, todos os extratos apresentaram um percentual de hemólise abaixo de 40%, indicando baixa toxicidade à membrana plasmática. Porém, nenhum extrato apresentou ação protetora contra o dano oxidativo ao DNA. Inclusive, os extratos CC, CF e UF em concentrações mais elevadas promoveram a degradação total ou parcial do DNA. Dessa forma, as espécies A. occidentale e S. tuberosa possuem compostos com grande potencial antioxidante, mas que necessitam de estudos mais aprofundados em relação a sua interação com outras moléculas orgânicas.

Palavras–chave: Anacardiaceae, atividade hemolítica, DNA, oxidação, radicais livres.

Abstract: Free radicals are reactive and unstable molecules resulting from metabolic reactions, in which their excess contributes to the development of oxidative stress, which can intensify cardiovascular, neurodegenerative and carcinogenic pathologies. Antioxidants act in the fight against these free radicals, causing these reactive molecules to be neutralized. Therapies using natural antioxidants have become relevant due to their low toxicity. This work aimed to evaluate the antioxidant capacity of cajueiro (Anacardium occidentale) and umbuzeiro (Spondias tuberosa). For this, different ethanol extracts of these plants were analyzed: cajueiro bark and leaf (CC and CF) and umbuzeiro bark and fruit (UC and UF). The extracts were submitted to the free radical capture test (ABTS+), evaluation of hemolytic activity and DNA protection assay against an oxidizing agent. It was observed that all extracts have an electron scavenging activity above 70% at the concentrations tested. In addition, all extracts showed a percentage of hemolysis below 40%, indicating low toxicity to the plasma membrane. However, no extract showed protective action against oxidative DNA damage. Even the CC, CF and UF extracts at higher concentrations promoted total or partial DNA degradation. Thus, the species A. occidentale and S. tuberosa have compounds with great antioxidant potential,

Key Word: Anacardiaceae, hemolytic activity, DNA, oxidation, free radicals.

INTRODUÇÃO

O estresse oxidativo no organismo ocorre devido a produção descontrolada dos radicais livres. Eles são moléculas ou átomos que possuem elétrons livres, onde a orbital externa está desemparelhada e são provenientes de fontes exógenas, como radiações, cigarros, dietas, medicamentos, entre outros (1,2), porém podem ser derivados a partir das vias endógenas, como subproduto do metabolismo (3).

Os radicais livres são consequências do processo de oxidação-redução, que faz com que uma molécula perca ou ganhe elétrons na sua última camada, tornando-a instável (4). Essa instabilidade pode ser responsável pelo processo de degradação de moléculas, provocando a morte celular (5,6). Terapias utilizando antioxidantes naturais ganharam importância no tratamento de doenças devido à baixa toxicidade, quando comparados aos antioxidantes sintéticos, que podem ser prejudiciais à saúde, provocando enfraquecimento muscular, perda de cabelo, entre outros (7).

A oxidação alimentícia contribui para uma deterioração mais rápida do alimento, sendo capaz de mudar sua textura, bem como resultar no desenvolvimento de odores e/ou toxinas (8). O uso de agentes antioxidantes também é importante na indústria alimentícia, pois evitam a rápida oxidação dos alimentos perecíveis, aumentando sua durabilidade e vida de prateleira (9).

Devido às consequências causadas pelos radicais livres, nos últimos anos, estudos sobre atividades antioxidantes de extratos vegetais têm ganhado destaque, devido a sua origem natural, de baixo custo e fácil acesso (10,11). Várias plantas já foram testadas na busca por compostos com atividade antioxidante. Dentre elas, destacam-se as espécies que possuem alta quantidade de polifenóis, uma vez que esses compostos possuem alta afinidade e estrutura que facilitam o processo de captura de radicais livres (6).

No Brasil existe uma grande diversidade vegetal, em comparação com o restante do mundo, com destaque para as regiões Norte e Nordeste (12). O uso de plantas nativas da região do Agreste Meridional na investigação de atividade antioxidante favorece o desenvolvimento de tecnologias e compostos que possibilitam um incremento na economia local e de valorização de atividades do campo sejam elas extrativas ou de plantio.

O presente trabalho utilizou extratos vegetais de duas espécies nativas da Caatinga, Anacardium occidentale (cajueiro-roxo) e Spondias tuberosa (umbu), com o objetivo de avaliar in vitro sua toxicidade e seu potencial antioxidante. Os resultados deste trabalho podem contribuir para a indústria farmacêutica e alimentícia, possibilitando mais opções de tipos de antioxidantes, diminuindo assim as consequências provocadas pelos efeitos dos radicais livres.

MATERIAL E MÉTODOS

Extratos vegetais

Neste estudo, foram utilizadas duas espécies de plantas, cajueiro (Anacardium occidentale, tombamento 80723) e umbuzeiro (Spondias tuberosa, tombamento 80725), cadastradas na plataforma do Sistema Nacional de Gestão do Patrimônio Genético e do Conhecimento Tradicional Associado. A partir dessas plantas, foram analisados quatro tipos de extratos etanólicos: CC – cajueiro casca; CF – cajueiro folha; UC – umbuzeiro casca; UF – umbuzeiro fruto. Tais extratos foram cedidos pelo grupo de pesquisa Produtos Naturais da Universidade de Pernambuco – Campus Garanhuns.

ABTS

O teste de 2,2-azino-bis (3-etilbenzotiazolina) 6-ácido sulfônico (ABTS+) (13,14,15,16), tem o objetivo de quantificar o potencial antioxidante de extratos, frente ao radical artificial ABTS+. Para a preparação do radical cátion ABTS+, foi utilizado ABTS 7 mM e K2S2O8 140 mM, deixando em repouso em temperatura ambiente, protegido da luz por 16 h. Após este período, a solução foi diluída em Etanol P.A., até alcançar uma absorbância de 0.05-0.7 em 734 nm. Em seguida, foi adicionado o extrato em diferentes concentrações (variando de 5 – 500 ug/mL), 450 uL de ABTS+ e etanol P.A., ajustando-se a um volume final de 500 uL. As amostras foram incubadas em banho ultrassônico por 6 min a temperatura ambiente. Em seguida, foram transferidas para uma microplaca de 96 poços para leitura da absorbância a 734 nm. Nesse ensaio, o TROLOX 0.1 mg/mL (6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametacromano-2-ácido carboxílico) foi utilizado como controle positivo nas concentrações de 0.5, 1.0, 2.0, 3.0, 4.0, 5.0 ug/mL. Para calcular o percentual de captura de radical livre, foi utilizada a seguinte fórmula:

Atividade Sequestradora (%) = 100 * [(Abs Controle – Abs amostra) / Abs Controle]

Ensaio de atividade hemolítica

Este foi baseado em Dacie e Lewis (17), com o objetivo de avaliar a toxicidade dos extratos em relação a membrana plasmática de eritrócitos. Para isso, foi realizada uma coleta de amostra de sangue humano tipo O+ (CEP N° 4.733.296), em tubo estéril contendo EDTA 0.1 g/dL. O sangue total foi centrifugado a 2500 rpm por 5 min e lavado três vezes com NaCl 0.9%, diluindo-se as hemácias a uma concentração de 0.5%. Diferentes concentrações dos extratos vegetais (10 ug/mL, 100 ug/mL, 500 ug/mL e 1000 ug/mL) foram adicionados às hemácias, ajustando-se a um volume final de 5 mL e incubando-se a temperatura ambiente por 1 h. Em seguida, as amostras foram centrifugadas a 2500 rpm por 5 min e o sobrenadante foi transferido para uma microplaca de 96 poços para leitura da absorbância a 540 nm. Para o controle positivo da hemólise foi utilizado TritonX-100 1%. Ao final da leitura, realizou-se o seguinte cálculo, para determinação do percentual de hemólise provocado pelo extrato:

% = Absorbância do teste x 100% / Absorbância do controle positivo

Ensaio de proteção ao DNA

O ensaio foi baseado em Stojkova et al. (18), com o objetivo de avaliar a capacidade protetora do extrato contra um agente oxidante, na tentativa de impedir a degradação do DNA. Para a reação, foi utilizado o DNA genômico da bactéria Escherichia coli ATCC 25922, o agente oxidante (H2O2 10 mM + Fe3Cl2 500 uM) e os extratos em diferentes concentrações (0.25, 0.50, 0.75 e 1.00 mg/mL). O DNA bacteriano foi quantificado por fotometria, utilizando os valores de absorbância a 260 nm até atingir uma concentração inicial de 200 ng/uL. Os extratos e 1 ug do DNA foram incubados por 10 min em temperatura ambiente em um volume de 10 uL. Logo em seguida, foi adicionado 10 uL do oxidante, incubando-se as amostras a temperatura de 37°C por 30 min. Como controle negativo, foram utilizadas as mesmas soluções sem a presença do agente oxidante, ajustando-se a um volume final de 20 uL. Após os ensaios de oxidação e inibição da oxidação, a quantificação do DNA foi realizada de forma indireta, utilizado o sistema de fotodocumentação SmartView Pro 1100 Imager System. para calcular a intensidade da fluorescência em gel de agarose corado com brometo de etídeo. Para isso, foi utilizanda como referência, uma banda de DNA contendo 200 ng de DNA.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

ABTS

Um dos métodos mais utilizados na investigação de potencial antioxidante em plantas é a análise de ABTS que é formada a partir da oxidação com persulfato de potássio que é reduzido na presença de antioxidantes doadores de hidrogênio. Neste estudo, foi investigado o potencial antioxidante de cada extrato em diferentes concentrações (5 ug/mL a 500 ug/mL), utilizando o Trolox (6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametacromano-ácido 2- carboxílico) como controle antioxidante padrão.

Para os extratos do cajueiro (CC e CF), foi observado que existe uma diferença percentual no potencial antioxidante de cada um deles. Analisando a Tabela 1, o extrato CC conseguiu maior captura dos radicais na concentração final de 450 ug/mL, com atividade sequestradora de 90.15%. No entanto em análise de variância fator duplo sem repetição (ANOVA) o Fator P foi igual a 0.493. Considerando um P maior que 0.05, estatisticamente não há variação entre as concentrações apontadas, o que permite afirmar que mesmo em concentrações menores como 50 ug/mL, o extrato CC apresenta o mesmo potencial antioxidante, sem que haja perda na eficácia.

Em relação ao extrato CF, foi observada uma ação antioxidante maior na concentração de 20 ug/mL, com atividade sequestradora de 90.45% (Tabela 2). Apesar da não homogeneidade das concentrações entre ambos os extratos, é possível confirmar que nas concentrações apresentadas, o extrato conseguiu inibir em mais de 80% os radicais presentes na reação. Ao submeter o resultado ao tratamento estatístico com ANOVA, observou-se um P igual a 0.510, o que indica não haver variância significativa entre as diferentes concentrações.

Ao analisar caule e folha do cajueiro, Santos et al. (19) obtiveram um percentual antioxidante maior que 50%, corroborando com os dados encontrados e ressaltando a importância desta espécie como fonte de antioxidantes naturais. De acordo com Correia, David e David (20), a inibição dos radicais livres pelos extratos das estruturas do cajueiro ocorre devido à alta quantidade de fenólicos na sua composição. Segundo Silva e Almeida (21), a atividade antioxidante se dá devido à capacidade redutora e sua estrutura química. Tal característica contribui na neutralização e captura dos radicais livres, agindo no início do processo oxidativo e evitando a propagação dos possíveis danos.

O extrato UC apresentou uma atividade sequestradora maior que 60% em todas as concentrações apresentadas na Tabela 3, onde a concentração de 450 ug/mL obteve melhor resultado (89.18%). Contudo, no teste ANOVA, o resultado de P foi igual a 0.430, indicando que não houve variância significativa nas diferentes concentrações.

Os resultados apresentados pelo extrato UF (Tabela 4), indicaram que baixas concentrações do extrato foram suficientes para atingir uma atividade sequestradora acima de 70%.

Em trabalhos anteriores, Araújo et al. (22) obtiveram um percentual antioxidante baixo na fruta do umbuzeiro (55.14%), em contrapartida ao percentual observado no galho que foi superior (68.92%). Possivelmente, na região da fruta existe uma quantidade inferior de compostos fenólicos quando comparada às outras estruturas da espécie. Por outro lado, através do teste ABTS, Brito et al. (23) identificaram uma atividade sequestradora de 98.57% na casca do fruto do umbuzeiro. Já Xavier et al. (24), utilizaram subprodutos do fruto (semente e casca) para produzir uma farinha e analisar seu potencial antioxidante. Os resultados foram promissores, pois indicaram uma alta atividade antioxidante (99.66%), devido a farinha ser rica em compostos fenólicos, além de possuir um alto teor nutricional.

Ensaio de atividade hemolítica

O ensaio de atividade hemolítica avalia a toxicidade do extrato em eritrócitos humanos, onde os resultados podem indicar seu uso seguro em seres vivos, ou mesmo recomendar limites de concentrações nas formulações propostas. Para isso, foram avaliadas diferentes concentrações dos extratos frente a uma suspensão de hemácias 0.5%.

Os dados obtidos neste teste podem ser visualizados na Tabela 5, onde os extratos de cajueiro (CC e CF) e umbuzeiro (UC e UF) resultaram num percentual de hemólise consideravelmente baixo (<40%, limite máximo aceitável). Isso permite que esses extratos possam ser utilizados em uma concentração mais elevada, sem que haja risco de toxicidade. Dentre eles, o extrato UC foi bastante promissor, pois em todas as concentrações testadas, obteve-se um percentual de hemólise abaixo de 10% e sem grandes variações, garantindo assim uma possibilidade de uso seguro e sem risco de toxicidade. Trabalhos testando atividade hemolítica nessas plantas ainda são escassos na literatura. Araújo et al. (25) testaram a capacidade hemolítica da casca do cajueiro, em concentrações semelhantes a este trabalho e adquiriu também resultados similares, comprovando assim que a ação hemolítica para casca é baixa. Nos ensaios hemolíticos desenvolvidos por Saidu et al. (26), com extrato folhas de cajueiro, o percentual de hemólise foi elevado, provavelmente por conta da alta concentração de taninos. Esses dados contradiz com o nível de hemólise detectado neste estudo (32.40%), quando utilizada a concentração de 1000 ug/mL. Ao analisar a atividade hemolítica de extratos do umbuzeiro (casca e fruto), Araújo (27) obteve também em seus resultados baixo percentual de hemólise para ambos os extratos, de forma semelhante aos resultados encontrados neste trabalho.

Ensaio de proteção ao DNA

A investigação da utilização de extratos vegetais para fins terapêuticos, apesar de ser algo que traz bastante benefício, ainda assim pode apresentar um certo grau de toxicidade. Com isso, é necessário estudos para que se comprove a baixa toxicidade dos extratos, avaliando a quantidade viável para o organismo. Uma das moléculas sensíveis aos processos oxidativos é o DNA, pois alterações em sua estrutura podem ocasionar mutações diversas, como substituição de bases, quebra da dupla-hélice, perda de interação entre DNA e proteínas regulatórias (28).

Alguns tipos de extratos de plantas vêm sendo estudados, com o objetivo de avaliar o grau de proteção ao DNA contra efeitos oxidativos (29). Na Figura 1 é possível visualizar os resultados obtidos neste ensaio para os quatro extratos.

A oxidação do DNA é um dos danos mais comuns causados pelos radicais livres, o qual irá induzir a degradação da molécula, contribuindo para doenças degenerativas (30). De acordo com Azqueta, Shaposhnikov e Collins (31), apesar do nosso organismo dispor de diversos mecanismos de reparo ao DNA, os danos provocados pela oxidação afetam um grande número bases, impossibilitando o processo de reparação efetivo do DNA.

Segundo Moreira et al. (32) e Viswanath et al. (33), o cajueiro e umbuzeiro possuem altos níveis de propriedades antioxidante. Porém, no presente trabalho, os extratos dessas espécies não garantiram proteção ao DNA frente ao agente oxidante, mesmo em diferentes concentrações. Foi possível observar ainda, que alguns extratos em concentrações mais elevadas promoveu a degradação total ou parcial do DNA (Figura 1). Por exemplo, nos extratos CC, CF e UF, a degradação ocorreu de maneira crescente, à medida que a concentração do extrato foi aumentando. Contudo, o extrato UC não promoveu degradação do DNA em nenhuma das concentrações testadas. Não há relatos na literatura sobre a ação de extratos vegetais capazes de degradar o DNA, sendo necessário uma investigação mais aprofundada sobre esse processo.

CONCLUSÕES

As propriedades antioxidantes pertencente ao cajueiro e umbuzeiro são de interesse na ciência, como também na indústria alimentícia. Os resultados obtidos neste trabalho evidenciaram que os extratos CC, CF, UC e UF apresentaram alto potencial de captura de radicais livres e baixo poder de hemólise, porém não foram capazes de proteger o DNA do dano oxidativo, causando em alguns casos a degradação do DNA. Dessa forma, o extrato UC mostra-se promissor por não apresentar toxicidade à membrana plasmática, nem ao DNA. Fica como perspectiva, a necessidade de novos testes in vitro e in vivo da ação antioxidante, além de identificar os compostos presentes nos extratos individualmente.

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