Capítulo de livro publicado no Congresso Brasileiro de Química dos Produtos Naturais. Para acessa-lo clique aqui.

Este trabalho foi escrito por:

Bruna Azevedo Balduino ^*; Anderson Henrique Venâncio  ; Michelle Carlota Gonçalves ; Mônica Aparecida da Silva ; Mateus Santos Carapiá ; Roberta Hilsdorf Piccoli

*Autor correspondente (Corresponding author)-Email: [email protected]

Resumo: Listeria monocytogenes é um patógeno alimentar capaz de se desenvolver em superfícies de processamento de alimentos, formar biofilmes e causar listeriose, devido à ingestão de alimentos contaminados. A utilização de óleos essenciais (OEs) como conservantes naturais é uma alternativa promissora para o fornecimento de alimentos seguros ao consumidor. Desse modo, o objetivo do estudo foi avaliar a ação antibacteriana isolada e combinada dos OEs de tomilho (TO), coentro (CO), orégano (O) e cravo botão (CB) sobre L. monocytogenes ATCC 19117. Para tanto, a concentração mínima bactericida (CMB) dos OEs foi determinada pela técnica de microdiluição em caldo em microplacas de poliestireno com 96 cavidades avaliando-se concentrações dos OEs entre 2 e 0,015% (v/v). Posteriormente, realizou-se o plaqueamento por microgotas, seguido de incubação das placas e a menor concentração do OE em que não houve crescimento do microrganismo em placa foi denominada CMB. Baseando-se nos valores da CMB e utilizando-se do Delineamento Composto Central Rotacional (DCCR), foram gerados 27 ensaios com a mistura dos OEs para avaliação da atividade antibacteriana in vitro. Encontrou-se uma CMB de 1,0% para os OEs de TO, O e CO e de 0,5% para o OE de CB indicando que todos os OEs apresentaram ação bactericida. Com relação as combinações, apenas 3 dos 27 ensaios não foram capazes de inibir o crescimento da cepa utilizada, o que demonstra que a ação combinada entre diferentes concentrações dos OEs foi eficaz para inibir o crescimento microbiano, comprovando que houve boa interação entre os óleos capaz de potencializar sua atividade antimicrobiana.

Palavras–chave: antimicrobianos naturais, Listeria monocytogenes, segurança do alimento

Abstract: Listeria monocytogenes is a foodborne pathogen capable of growing on food processing surfaces, forming biofilms and causing listeriosis due to ingestion of contaminated food. The use of essential oils (EOs) as natural preservatives is a promising alternative for providing safe foods to consumers. Thus, the aim of the study was to evaluate the isolated and combined antibacterial action of thyme (TO), coriander (CO), oregano (O) and clove (CB) EOs on L. monocytogenes ATCC 19117. For this purpose, the minimum bactericidal concentration (MBC) of the EOs was determined by the broth microdilution technique in polystyrene microplates with 96 wells, evaluating concentrations of the EOs between 2 and 0,015% (v/v). Subsequently, microdroplet plating was performed, followed by incubation of the plates and the lowest concentration of EO in which there was no growth of the microorganism in the plaque was called MBC. Based on the MBC values and using the Rotational Central Composite Design (RCCD), 27 assays were generated with the mixture of EOs to evaluate the in vitro antibacterial activity. A MBC of 1.0% was found for the EOs of TO, O and CO and of 0.5% for the EO of CB, indicating that all the EOs showed bactericidal action. Regarding the combinations, only 3 of the 27 assays were not able to inhibit the growth of the strain used, which demonstrates that the combined action between different concentrations of EOs was effective in inhibiting microbial growth proving that there was a good interaction between the oils capable of enhancing their antimicrobial activity.

Key Word: natural antimicrobials, Listeria monocytogenes, food safety

INTRODUÇÃO

Listeria monocytogenes é uma bactéria Gram-positiva, anaeróbia facultativa, em formato de bastonete, não formadora de esporos e que possui a capacidade de sobreviver em condições adversas. Devido sua capacidade de se desenvolver em altas concentrações de sal, ampla faixa de pH e temperatura, tolerar baixa atividade de água e habilidade de se fixar em superfícies de processamento de alimentos formando biofilmes em diferentes locais de uma instalação de processamento, L. monocytogenes é considerada um patógeno de origem alimentar de grande preocupação para a indústria alimentícia (1; 2; 3; 4; 5; 6).

A principal forma de contaminação por L. monocytogenes ocorre por meio da ingestão de alimentos contaminados, como carnes, produtos cárneos, peixes, frutos do mar, leite cru, produtos lácteos, ovos, frutas e vegetais. Já que, uma vez ingerido, esse patógeno pode causar listeriose, uma doença de origem alimentar que apresenta altas taxas de letalidade (3; 7).

A listeriose acomete principalmente indivíduos mais susceptíveis como idosos, mulheres grávidas, recém nascidos e indivíduos imunocomprometidos e pode ocorrer de duas formas. A listeriose não invasiva é a forma mais branda da doença, que normalmente ocorre como uma gastroenterite febril e a listeriose invasiva se caracteriza como a forma mais severa da doença, que ocorre como uma infecção sistêmica e está relacionada a altas taxas de hospitalização e letalidade (8; 9; 10; 11).

Desse modo, a indústria utiliza os conservantes como uma forma de evitar a contaminação por patógenos e o desenvolvimento de microrganismos deterioradores para garantir aos consumidores um alimento seguro e com maior vida útil. Esses conservantes podem ser sintéticos ou naturais, sendo os sintéticos ainda muito utilizados (12).

No entanto, devido a uma busca cada vez maior dos consumidores por segurança e saudabilidade, há um maior interesse em substituir os conservantes sintéticos por alternativas naturais, dentre as quais se destacam os óleos essenciais (12; 13; 14; 15; 16).

Os óleos essenciais são misturas complexas, compostas por substâncias voláteis e odoríferas, provenientes do metabolismo secundário de plantas (17;18). Sendo muito conhecidos por apresentarem propriedades antibacterianas, antifúngicas, antiparasitárias, antivirais e antioxidantes (19). Desse modo, esses compostos naturais aromáticos, não tóxicos e biologicamente ativos possuem grande aplicação industrial, seja no setor de alimentos, cosméticos, medicamentos, entre outros (15).

Os óleos essenciais são classificados como GRAS (Generally Recognized As Safe) pela Food and Drug Administration (FDA), o que permite sua utilização em alimentos e os tornam uma alternativa promissora para a substituição dos conservantes sintéticos na indústria de alimentos (20).

Embora sejam muito utilizados na indústria como aromatizantes, são considerados antimicrobianos naturais com potencial para combater patógenos alimentares e microrganismos deterioradores e, portanto, podem ser considerados como um conservante de alimentos eficaz (15; 16).

Entretanto, um fator limitante para o uso de óleos essenciais como conservantes naturais em alimento são seu forte sabor e odor, pois, dependendo da concentração em que o óleo é utilizado pode causar alterações sensoriais no produto que muitas vezes não são desejáveis. Portanto, uma forma de minimizar essa interferência sensorial é a utilização de combinações entre diferentes óleos essenciais. Já que, quando utilizados de forma combinada pode ocorrer efeitos sinérgicos entre seus componentes, o que contribui para um aumento da atividade antimicrobiana e, consequentemente, possibilita a utilização de concentrações mais baixas (10; 15; 16; 20; 21; 22).

Diante do exposto, o objetivo do estudo foi avaliar a ação antibacteriana isolada e combinada dos óleos essenciais de tomilho, coentro, orégano e cravo botão sobre L. monocytogenes ATCC 19117.

MATERIAL E MÉTODOS

Local e condução do experimento

O experimento foi realizado no Laboratório de Microbiologia de Alimentos no Departamento de Ciência dos Alimentos da Universidade Federal de Lavras (UFLA), na cidade de Lavras-MG, Brasil.

Óleos essenciais

 Os óleos essenciais de tomilho, coentro, orégano e cravo botão foram adquiridos da empresa Ferquima®.

Microrganismo, manutenção e padronização do inóculo

A cepa bacteriana utilizada no estudo foi Listeria monocytogenes ATCC 19117, cedida pelo Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde (INCQS) da Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ) e mantida no Laboratório de Microbiologia de Alimentos do Departamento de Ciência dos Alimentos da UFLA.

A cepa de L. monocytogenes foi ativada em caldo triptona de soja acrescido de 0,6% (m/v) de extrato de levedura (TSB-YE), seguida de incubação a 37°C por 24h. A cultura estoque foi obtida por transferências de alíquotas de 1 mL da cultura ativa para microtubos que foram centrifugados a 7700 xg por 5 minutos. Após a centrifugação o sobrenadante foi descartado e a massa celular obtida foi ressuspensa com adição e homogeneização de 1 mL de meio de congelamento (glicerol: 15 ml; peptona bacteriológica: 0,5g; extrato de levedura: 0,3g; NaCl: 0,5g; água destilada: 100 ml). A cultura estoque foi mantida a -18°C durante o período de execução do experimento.

A padronização do inóculo a 10⁸ UFC/mL foi realizada mediante curva de crescimento, na qual o desenvolvimento do microrganismo foi monitorado por leituras periódicas da absorbância (D.O. 600 nm) em espectrofotômetro (BEL SP-2000) e plaqueamento de alíquotas da cultura em ágar triptona de soja acrescido de 0,6% de extrato de levedura (TSA-YE). As placas foram incubadas a 37°C por 24h para posterior quantificação das colônias e padronização das culturas.

Os inóculos foram obtidos pela transferência de alíquotas de 1 mL da cultura estoque para tubos de ensaio contendo 10 mL de TSB-YE e incubação a 37°C por 24h. Após esse período, alíquotas de 1 mL das culturas foram transferidas para frascos contendo 100 ml de TSB-YE e incubadas a 37°C pelo tempo necessário para atingir 10⁸ UFC/mL.

Determinação da Concentração Mínima Bactericida (CMB)

A concentração mínima bactericida (CMB) dos óleos essenciais foi determinada pela técnica de microdiluição em caldo (23), com adaptações, em microplacas de poliestireno com 96 cavidades. Os óleos essenciais foram utilizados nas concentrações de 2; 1; 0,5; 0,25; 0,12; 0,06; 0,03; 0,015% (v/v).

            Alíquotas de 10 µL da cultura padronizada foram inoculadas nas cavidades das microplacas contendo 150 µL de TSB-YE acrescido de Tween 80 e das concentrações dos óleos essenciais. As microplacas foram incubadas a 37°C por 24h. Após esse período, alíquotas de 10 μL das culturas de cada cavidade foram plaqueadas em TSA-YE empregando-se a técnica de plaqueamento em microgotas e incubadas a 37°C por 24 horas. A menor concentração do óleo em que não houve crescimento do microrganismo em placa foi denominada CMB. O experimento foi realizado com três repetições em triplicata. Foram utilizados um controle negativo contendo TSB-YE acrescido de 0,5% de Tween 80 e das concentrações dos óleos essenciais e um controle positivo, contendo TSB-YE acrescido de Tween 80 e 10 µL da cultura padronizada.

Combinação entre os óleos essenciais

A partir da concentração mínima bactericida dos óleos essenciais testados in vitro, foram gerados vinte e sete ensaios utilizando-se o delineamento DCCR (Delineamento Composto Central Rotacional) no programa Chemoface versão 1.5, utilizando “Experimetal design”, sendo as variáveis codificadas “+2” e “-2” calculadas de acordo com a CMB encontrada para cada óleo. É possível observar as variáveis codificadas representando as diferentes proporções dos óleos essenciais utilizados em cada ensaio na Tabela 1.

A avaliação da atividade antimicrobiana in vitro dos vinte e sete ensaios foi realizada em tubos de ensaio. Para tanto, alíquotas de 50 μL de cultura de L. monocytogenes padronizada em 10⁸ UFC/mL foram transferidas para tubos contendo 5mL de caldo TSB-YE acrescido de 0,5% de Tween 80 e das diferentes combinações entre os óleos essenciais, seguido de homogeneização dos tubos em agitador tipo Vortex e incubação a 37°C por 24h. Após incubação, alíquotas de 10 μL foram transferidas para placas de Petri contendo TSA-YE, para realização do plaqueamento pela técnica de microgotas. As placas foram incubadas a 37°C por 24h e, após esse período, foi observado quais ensaios foram capazes de inibir o crescimento da bactéria. O experimento foi realizado com três repetições em triplicata.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

As concentrações mínimas bactericidas encontradas para os óleos essenciais testados sobre L. monocytogenes ATCC 19117 podem ser observadas na Tabela 2.

Todos os óleos essenciais apresentaram atividade bactericida quando testados in vitro sobre L. monocytogenes ATCC 19117. Sendo o óleo essencial de cravo botão o que apresentou a menor CMB e, portanto, o que obteve a melhor ação antibacteriana.

A ação antimicrobiana dos óleos essenciais está relacionada a seus compostos bioativos como aldeídos, flavonoides, ácidos fenólicos e terpenos. Desse modo, alguns de seus componentes majoritários como timol, carvacrol, eugenol, cinamaldeído, limoneno, carvona, α- e β-pineno e ρ-cimeno são exemplos de compostos com atividade antilisterial (12).

Devido ao grande número de componentes químicos dos óleos essenciais, sua atividade antimicrobiana não está relacionada a um único mecanismo de ação e sim a várias alterações que ocorrem em toda a célula microbiana, como alteração do perfil de ácidos graxos e da estrutura da membrana celular, aumento da permeabilidade, extravasamento do conteúdo celular, danos às proteínas de membrana, coagulação do citoplasma, inibição da funcionalidade da parede celular e depleção da força próton motriz (12; 24). Já que, os componentes hidrofóbicos dos óleos essenciais interagem com os lipídeos presentes na membrana celular do microrganismo, o que resulta nos danos metabólicos e morte celular (20).

Além disso, a eficiência dos óleos essenciais pode ser afetada por diversos fatores como método de extração do óleo, identificação e quantificação dos constituintes químicos, microrganismo alvo e interação com a matriz alimentar (20).

Pensando-se na aplicação em alimentos como conservante natural, é preciso considerar que devido as possíveis interferências da matriz alimentar na ação antimicrobiana dos óleos essenciais, pode ser necessário utilizar maiores concentrações para se ter a mesma ação antimicrobiana dos sistemas in vitro.

Desse modo, alternativas como a combinação entre diferentes óleos para reduzir as alterações sensoriais são necessárias. A ação bactericida das combinações entre os óleos essenciais testadas in vitro sobre L. monocytogenes ATCC 19117 pode ser observada na Tabela 3.

Apenas os ensaios 1 (0,04% orégano + 0,04% coentro + 0,04% tomilho + 0,009% cravo botão), 2 (0,04% orégano + 0,04% coentro + 0,04% tomilho + 0,03% cravo botão) e 17 (0,085% coentro + 0,085% tomilho + 0,019% cravo botão) não foram capazes de inibir o crescimento de L. monocytogenes ATCC 19117 in vitro.  É possível perceber que os ensaios 1 e 2 correspondem às menores concentrações totais das combinações entre os óleos essenciais, já no ensaio 17, não foi utilizado o óleo essencial de orégano, o que demonstra a importância desse óleo para inibição de L. monocytogenes.

Com relação aos demais ensaios, pode-se dizer que houve uma boa interação entre os óleos essenciais, pois a combinação entre diferentes concentrações dos óleos, inferiores aos valores da CMB, foram capazes de inibir o crescimento microbiano. Desse modo, o uso de concentrações mais baixas para obter uma atividade antibacteriana semelhante poderá resultar em uma alteração sensorial reduzida ao ser aplicado em um produto alimentício (25).

Ao trabalhar com combinações entre óleos essenciais é preciso considerar que pode ocorrer um efeito sinérgico, aditivo ou antagônico. Quando a atividade antimicrobiana da combinação é igual à soma dos efeitos individuais tem-se um efeito aditivo, quando a atividade antimicrobiana das substâncias combinadas é maior que a soma dos efeitos individuais tem-se o sinergismo e quando a atividade antimicrobiana de um ou ambos compostos é significativamente maior do que a de suas misturas tem-se o antagonismo (26).

Pensando-se nos efeitos sinérgicos e aditivos, o uso de combinações são uma alternativa promissora para aumentar a eficácia dos óleos essenciais aplicados em alimentos. Efeitos sinérgicos podem ocorrer na combinação entre diferentes óleos essenciais, como também na combinação de óleos essenciais e aditivos alimentares e entre óleos essenciais e antibióticos (25; 27).

Assim como neste trabalho, alguns estudos tem relatado a inibição de L. monocytogenes por óleos essenciais de forma isolada ou combinada. As atividades antibacterianas dos óleos essenciais de orégano (Origanum vulgare L.) e alecrim (Rosmarinus officinalis L.) foram avaliadas de forma isolada e combinada sobre L. monocytogenes ATCC  7644 e observou-se que a adição de 1,25 µL/mL do óleo essencial de orégano, 20 µL/mL do óleo essencial de alecrim e a combinação entre os dois óleos (0,3125 µL/mL de orégano + 5 µL/mL de alecrim) reduziram a população bacteriana a valores inferiores a dois ciclos log após 4h, 24h e 12h de exposição, respectivamente (28).

Combinações binárias e ternárias dos óleos essenciais de canela, manuka e segurelha foram testadas sobre L. monocytogenes ATCC 7644 demonstrando vários efeitos sinérgicos que sugerem o potencial para utilizar baixas concentrações de óleos essenciais que podem ser úteis em plantas de processamento de alimentos (29).  Efeitos sinérgicos sobre L. monocytogenes também foram demonstrados pela combinação de diferentes proporções de óleos essenciais de mostarda e orégano mexicano demonstrando eficácia antimicrobiana contra o microrganismo quando testado in vitro (30).

Portanto, os óleos essenciais testados neste estudo apresentaram atividade bactericida sobre L. monocytogenes e, embora tenham sido eficazes quando utilizados de forma isolada, as combinações permitem a utilização de menores concentrações, podendo reduzir custos e os impactos sensoriais, sem que se perca seu efeito antimicrobiano, garantindo segurança (30).

CONCLUSÕES

Os óleos essenciais de orégano, coentro, tomilho e cravo botão apresentaram ação bactericida sobre L. monocytogenes ATCC 19117 quando usados de forma isolada e combinada. Sendo que, 24 dos 27 ensaios com diferentes combinações entre os óleos essenciais foram eficazes para inibir o crescimento do microrganismo. O que demonstra que a combinação entre os óleos é uma alternativa promissora para que eles possam ser utilizados em alimentos como conservantes naturais, já que permitem a utilização de menores concentrações dos óleos essenciais com intuito de reduzir a interferência sensorial.

No entanto, para comprovar a eficácia dos óleos essenciais e utilizá-los como conservantes naturais deve-se considerar as alterações que a matriz alimentar pode causar em seu mecanismo de ação, sendo necessário testar sua aplicação em algum produto alimentício, além de realizar mais testes com diferentes cepas.

AGRADECIMENTOS

Os autores agradecem o apoio da Universidade Federal de Lavras (UFLA) e das agências CAPES, FAPEMIG e CNPq.

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