Resumo expandido publicado nos Anais da III Mostra dos Trabalhos de Conclusão de Curso da Especialização em Vigilância Laboratorial em Saúde Pública. Para acessa-lo clique aqui.

Este trabalho foi escrito por:

Rafaela Nascimento Cont¹; Gabriela Bastos Cabral²

¹Estudante do Curso de Especialização em Vigilância Laboratorial em Saúde Pública – CLR IAL; E-mail: [email protected]

² Núcleo de Ciências Biomédicas do Instituto Adolfo Lutz Regional de Santos, SP

Resumo: A febre Chikungunya, é a doença causada pela infecção do vírus Chikungunya, um alphavirus, da família Togaviridae, transmitida por mosquitos Aedes aegypti e Aedes albopictus, que circula no Brasil desde 2014.No ano vigente, até setembro, ocorreram 87.748 casos prováveis, e 10 óbitos confirmados por critérios laboratoriais. A co-circulação de arboviroses, como Dengue e Zika, é uma realidade em muitas regiões, o que dificulta o diagnóstico clínico, devido a semelhança dos sintomas entre essas doenças. Para um diagnóstico mais específico, utiliza-se os testes laboratoriais. Entretanto, um dos desafios primários na interpretação dos testes sorológicos de infecções agudas por arboviroses, são os resultados falsos-positivos devido a reatividade-cruzada. Através de uma revisão bibliográfica, demonstrou-se a ocorrência de reação-cruzada nos testes sorológicos de Chikungunya em diversos estudos, variando de 1% a 37%, dependendo do kit comercial e da quantidade de amostras utilizados. Além disso, apresentamos estudos para o desenvolvimento de testes capazes de minimizar essa ocorrência.

Palavras-chave: arboviroses; chikungunya; ELISA; reação-cruzada

INTRODUÇÃO

A febre Chikungunya (CHIKF), é a doença causada pela infecção do vírus Chikungunya (CHIKV), um alphavirus, da família Togaviridae, transmitida por mosquitos Aedes aegypti e Aedes albopictus principalmente. O CHIKV foi isolado pela primeira vez na década de 50, na Tanzânia, onde originou-se o termo Chikungunya, derivada da língua Makonde, que significa “encurvado”, referindo-se a forma que o indivíduo infectado fica devido as dores nas articulações(MORCERF et al., 2015).

No Brasil, os anos de maior incidência de casos de CHIKF até o ano vigente, foram 2016 e 2017, com mais de 151.000 casos/ano, e mais de 190 óbitos (BRASIL, 2018). Em 2021, foi emitido um alerta sobre a ocorrência de surto de Chikungunya no estado de São Paulo, localizado mais especificamente na região da Baixada Santista, com aumento de 380% nas notificações e 33 vezes mais casos confirmados comparado ao ano anterior (SÃO PAULO, 2021).

Assim como a CHIKF, outras arboviroses, como Dengue, Zika e Febre amarela, existem há séculos, e são encontrados frequentemente, porém não exclusivamente, em regiões equatoriais e subtropicais do planeta. Ao longo da história, observa-se o aumento dos casos de surtos e epidemias ao redor do mundo, justificados pela globalização, adaptação dos vetores e falhas no controle das doenças, tornando-se assim uma problemática de saúde pública (FERREIRA et al., 2021; ZAID et al., 2021).

Uma realidade em diversos países, é a co-circulação dessas doenças, o que traz alguns desafios para um diagnóstico adequado. Por apresentarem sintomas muito similares, o diagnóstico clínico é dificultoso, exigindo assim a confiabilidade diagnóstica dos testes laboratoriais (NATRAJAN; ROJAS; WAGGONER, 2019; LIMA et al., 2021).

Por ser uma região endêmica para outras arboviroses, principalmente a dengue que causa epidemias no país há mais de 40 anos, se faz necessário a compreensão sobre a capacidade dos testes diagnósticos em diferenciar essas doenças. O objetivo deste estudo foi realizar um levantamento bibliográfico sobre os principais intercorrentes e desafios encontrados no diagnóstico sorológico da infecção pelo Chikungunya.

MATERIAL E MÉTODO

Foi realizada uma revisão bibliográfica priorizando literaturas publicadas nos últimos 5 anos, utilizando bases de dados da National Center for Biotechnology Information (NCBI – PubMed). Artigos que abordavam o tema da febre Chikungunya, como: diagnóstico sorológico, reação-cruzada e co-circulação de arboviroses foram incluídos no estudo.

RESULTADO E DISCUSSÃO

Para um diagnóstico mais específicos, utiliza-se os testes laboratoriais. Atualmente, as duas principais formas de diagnóstico de CHIKV e diferenciação com outras doenças são os testes moleculares e exames sorológicos. A partir dos testes moleculares temos a detecção do RNA viral por RT-PCR (Reação em Cadeira da Polimerase com Transcriptase Reversa), até o quinto dia após o início dos sintomas. Já os testes sorológicos, detecta-se a presença de anticorpos IgM/IgG após o sexto dia do início dos sintomas (BRASIL, 2017).

Sabe-se que a detecção de anticorpos específicos é de suma importância na infecção por arboviroses. A curta duração da viremia, torna os testes sorológicos a melhor opção para o diagnóstico, visto que dificilmente os pacientes procuram o auxílio médico no início dos sintomas. Assim, algumas das técnicas de diagnóstico sorológico que podem ser utilizados são ELISA, MAC-ELISA, testes imunocromatográficos (teste rápido) e o teste de neutralização por redução de placas (PRNT) por exemplo (FISCHER et al., 2021).

O teste padrão ouro para confirmação pela sorologia é o teste de neutralização (PRNT). Neste método, podemos observar o grau de infecção celular, após a incubação do vírus com anticorpos neutralizantes presentes no soro. O resultado fornece uma estimativa direta da quantidade de anticorpos funcionais. Seus dados podem ser úteis principalmente na detecção de casos subclínicos, auxiliando na avaliação do impacto da doença, na compreensão do comportamento do vírus e no desenvolvimento de vacina, entretanto, é uma metodologia dispendiosa, tanto de custos como de tempo, é de difícil acesso e interpretação subjetiva (MARQUES et al., 2017; PIANTADOSI; KANJILAL, 2020). 

O IgM Antibody Capture Enzyme-linked immunosorbent assay (MAC-ELISA) é usado para uma detecção mais específica de IgM. Comparado ao ELISA, a competição de IgG é menor, reduzindo o risco de ligações não-específicas. Em uma avaliação do Center for Disease Control and Prevention (CDC), os resultados positivos no MAC-ELISA, tiveram 90% de concordância com PRNT (JOHNSON; RUSSELL; GOODMAN, 2016; PIANTADOSI; KANJILAL, 2020).

A partir dessas considerações, os testes mais avaliados, utilizados e disponíveis são, portanto, ELISA e o teste rápido. Segundo recomendações do Ministério da Saúde, os testes imunocromatográficos devem ser utilizados como técnicas de triagem, dessa forma, quando um resultado é positivo, a confirmação por ELISA é necessária (BRASIL, 2017).

Segundo Piantadosi e Kanjilal (2020), um dos desafios primários na interpretação dos testes sorológicos de infecções agudas por arboviroses, são os resultados falsos-positivos devido a reatividade-cruzada.

 A reação-cruzada é definida como a habilidade de elementos estruturalmente diferentes realizarem a mesma função. Agentes infecciosos frequentemente compartilham similaridade molecular com antígenos-próprios, os quais os auxiliam no escape do sistema imune do hospedeiro. Assim como também pode ocorrer reação-cruzada entre epítopos de patógenos diferentes, possibilitando a neutralização de ambos, o que pode ser uma boa escolha para o desenvolvimento de vacinas contra essas duas ou mais doenças (ROJAS et al., 2018; JAIN; SALUNKE, 2019).

            A provável razão da ocorrência dessa multi-especificidade nos anticorpos, é a existência de epítopos comuns em diferentes antígenos. O mimetismo molecular é a semelhança sequencial, estrutural, química ou imunológica compartilhada entre dois epítopos que os leva a interagir com o mesmo paratopo, ademais os anticorpos podem utilizar diferentes paratopos para a ligação com epítopos semelhantes. Essa promiscuidade na ligação de anticorpos contra antígenos diferentes não está diretamente relacionada a especificidade e nem com a interação de baixa afinidade desses anticorpos segundo Jain e Salunke (2019).

A reação-cruzada entre vírus de famílias diferentes, como o caso do CHIKV com o DENV ou ZIKV, é muitas vezes reportado como um evento improvável, devido suas diferenças estruturais e antigênicas. Entretanto, há alguns estudos que demonstram essa ocorrência.

Lima et al. (2021) reportou em seu estudo, a reatividade-cruzada com amostras positivas para Dengue em um kit comercial ELISA CHIKV IgM (Euroimmun). As amostras para Dengue, foram coletadas antes da entrada do CHIKV no Brasil, excluindo a possibilidade de co-infecção, além da retestagem dessas amostras com testes moleculares e sorológicos. No geral, 37% (58 de 155 amostras) dos pacientes positivos para DENV também positivaram no ELISA CHIKV IgM.

Em uma pesquisa realizada na Tailândia por Suwanmanee et al. (2018), 6 amostras positivas para DENV (RT-PCR), no total de 129 amostras (4,6%), apresentaram reação-cruzada com CHIKV, mais especificamente amostras do sorotipo DENV-2 e DENV-3.

Na análise para o desenvolvimento de um teste rápido diferencial para DENV e CHIKV, Wang et al. (2019) observou a presença de alta reatividade-cruzada entre proteínas do envelope do sorotipo DENV-3 e DENV-4, com anticorpos anti-CHIKV. Essas proteínas então, não foram utilizadas para compor o teste, limitando um pouco os resultados, porém evitando ligações equivocadas.

No estudo de Mendoza et al. (2019), uma análise de reação-cruzada foi realizada entre diferentes kits de ELISA para CHIKV. Em amostras positivas para flavivírus, confirmados por PRNT, a porcentagem de falsos-positivos para os teste da Euroimmun IgM, Euroimmun IgG e Abcam IgG foram 10,7%, 1,2% e 1,2% respectivamente. Neste mesmo estudo, reação-cruzada intrafamiliar (4%) para os kits da Euroimmun (IgM e IgG) também foram observados.

Quando se utiliza epítopos mais específicos como base do ELISA, como utilizou Kam et al. (2015), a porcentagem de falsos-positivos para flavivírus é relativamente baixa (7% – 4/60 amostras), porém para vírus do mesmo gênero, no caso Alphavirus, devido à proximidade filogenética, mais da metade dos pacientes com alphaviroses tiveram ELISA positivo, e 50% dessas amostras também apresentaram PRNT reagente.

No cenário epidemiológico atual do Brasil, não há outro alfavírus de grande circulação no país, como o CHIKV. Entretanto, o virus Mayaro (MAYV), do mesmo gênero, é endêmico na região Amazônica, e a ocorrência de reatividade cruzada foi demostrada por Fischer et al. (2020) e Fumagalli (2018). Portanto, é importante a constante atenção a essa doença também, sendo essenciais medidas de prevenção e controle, através de notificações e desenvolvimento de diagnósticos diferenciais(BARROS et al., 2021).

A proposta de Damle et al. (2016) foi desenvolver um anticorpo anti-proteina C, para sua utilização no MAC-ELISA. Durante a execução do teste com o anticorpo, observou-se 3% de reação-cruzada com Dengue (1/35 amostras), 10% com leptospirose (1/10 amostras) e 10% para Fator-reumatóide (1/10).

É necessário o desenvolvimento de testes laboratoriais capazes de diferenciar os casos de arboviroses de forma segura e rápida. Isso será possível, através de exames sensíveis e específicos, que possam ser facilmente performados, e que viabilizem tempo e custo para sua realização.

Damle et al. (2016) desenvolveu um MAC ELISA, utilizando anticorpos contra a proteína C (capsídeo) do CHIKV. Comparando com o MAC ELIZA CHIKV desenvolvido no Instituto Nacional de Virologia de Pune (NIV MAC ELISA) a sensibilidade do teste foi de 87% e 100% de especificidade.

A possibilidade de uma detecção simultânea, de forma sensível e específica seria o ideal para regiões de co-circulação de arboviroses. Wang et al., (2019), desenvolveu um teste imunocromatográfico colorimétrico, capaz de detectar IgM e IgG contra DENV e CHIKV simultaneamente.

CONCLUSÕES

A CHIKF é uma doença debilitante, e desde sua introdução no país, vem gerando preocupações na saúde pública.  A eminência de surtos e epidemias em diferentes regiões, chama atenção para certos cuidados no manejo da doença.

A co-circulação de arboviroses, dificulta o diagnóstico baseado nos sintomas, exigindo assim, a confiabilidade dos testes laboratoriais para um diagnóstico correto. Apesar da principal medida de prevenção dessas doenças ser a mesma, ou seja, controle dos vetores, um diagnóstico incorreto dificulta a escolha do tratamento, e o monitoramento do cenário epidemiológico.

Os métodos sorológicos são muito utilizados para o diagnóstico, devido sua praticidade e custo-efetividade, porém, está sujeito a interferentes, como a reação-cruzada. Por meio de estudos, pode-se observar a ocorrência de resultados falsos-positivos, mesmo entre vírus de famílias diferentes.

            Para contornar esse problema, é importante a combinação de testes, aumentando a acurácia diagnóstica, por meio da detecção de antígeno e anticorpo, como a associação dos testes moleculares com os sorológicos. Além disso, temos diversos estudos para o desenvolvimento de novos testes, capazes de diferenciar essas doenças, ainda que seja um desafio obter um teste com alta sensibilidade e especificidade. 

REFERÊNCIAS

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