Resumo expandido publicado nos Anais da III Mostra dos Trabalhos de Conclusão de Curso da Especialização em Vigilância Laboratorial em Saúde Pública. Para acessa-lo clique aqui.

Este trabalho foi escrito por:

Gabrielle Yuriko Batista de Moraes¹; Ana Cristina Scarparo de Miranda²; Tamiko Ichikawa Ikeda²; Aurea Silveira Cruz Garçon²

¹Estudante do Curso de Especialização em Vigilância Laboratorial em Saúde Pública – IAL; E-mail:  [email protected]

²Docente/Pesquisadora do Núcleo de Cultura de Células – NCC – IAL.

Resumo: As culturas de células são amplamente utilizadas em diversas áreas, na pesquisa ou diagnóstico, além de serem uma excelente alternativa ao uso de testes com animais. Essas culturas devem ser autenticadas, tendo as suas características conhecidas, a espécie de origem comprovada e estarem livres de contaminação cruzada e microbiológica, especialmente por micoplasmas, o que pode evitar a perda de recursos financeiros, conhecimento científico e a credibilidade dos trabalhos publicados. Esta revisão tem como objetivo abordar e discorrer sobre algumas técnicas recomendadas para autenticação celular, assim como suas vantagens e limitações, colaborando com a conscientização da comunidade científica sobre a necessidade de utilizar linhagens celulares obtidas de coleções reconhecidas e a importância do constante monitoramento das mesmas. Sendo assim, foi realizada uma vasta busca na literatura sobre este tema e, de acordo com o levantamento, a comprovação da ausência de micoplasmas pode ser feita por cultura microbiológica, coloração fluorescente, técnica de ELISA, PCR, microscopia eletrônica ou método bioquímico (MycoAlert^TM). Com relação à verificação de espécie, as metodologias disponíveis são eletroforese de isoenzimas, análise cromossômica, marcação imunológica e técnicas de biologia molecular para análise de regiões conservadas do genoma. Como toda técnica possui vantagens e limitações, deve-se empregar mais de uma para assegurar a identidade e ausência de contaminantes da linhagem utilizada. Além do uso destes ensaios para controle é essencial a utilização de técnicas assépticas em todas as etapas da manutenção das culturas, evitando a introdução de possíveis contaminantes. Todos estes cuidados são fundamentais para o sucesso dos estudos realizados com culturas celulares.

Palavras–chave: autenticação de linhagens celulares; contaminação; contaminação cruzada; cultura de células.

INTRODUÇÃO

Cultura de células é definida como um modelo in vitro que permite manter as células vivas, não mais organizadas em tecidos e órgãos. Essa técnica apresenta muitas vantagens em comparação aos modelos in vivo que utilizam animais em ensaios experimentais, tais como homogeneidade das linhagens, são mais econômicos, de fácil manipulação e controle, além de ser uma alternativa para substituir e/ou reduzir a utilização de animais em pesquisa. Suas aplicações vão da área de pesquisa ao diagnóstico, principalmente em Biologia Celular e Molecular, Bioquímica, Virologia, Farmacologia, Toxicologia e Oncologia, entre outras (PERES; CURI, 2005; ALVES; GUIMARÃES, 2010; MIGITA, 2012; GONÇALVES; SOBRAL, 2020).

Para que o conhecimento produzido com a utilização de células seja válido e reprodutível, é essencial que as linhagens celulares sejam autenticadas, ou seja, que sua identidade seja confirmada, espécie de origem comprovada e estejam livres de contaminantes, seja micro-organismos e/ou outras linhagens celulares. O uso de culturas contaminadas ou erroneamente identificadas gera resultados inválidos e consequentemente compromete a credibilidade da pesquisa realizada, além de disseminar informações equivocadas (CAPES-DAVIS et al., 2010; MARX, 2014; FREEDMAN et al., 2015; HORBACH; HALFFMAN, 2017; COSME et al., 2017).

Os principais micro-organismos que podem contaminar as culturas celulares são as bactérias, fungos e vírus. Dentre esses, os micoplasmas são as menores bactérias de vida livre, não possuem parede celular e pertencem à classe Mollicutes. São os contaminantes mais comuns em culturas celulares e um dos mais difíceis de identificar, podendo permanecer indetectáveis por várias passagens e alterar diversas características e respostas celulares (DREXLER; UPHOFF, 2002; MAHMOOD; ALI, 2017). Outro tipo de contaminação que pode ocorrer durante a cultura de células é a cruzada, quando diferentes linhagens celulares são misturadas ou identificadas erroneamente, resultando em uma cultura que não é mais condizente ao seu doador, tecido ou espécie de origem (ICLAC, 2022). As estimativas são de que cerca de 20 a 30 % das linhagens celulares possam estar contaminadas com outras ou erroneamente identificadas e de 5 a 35 % por micoplasmas, demonstrando a extensão desse problema (DREXLER; UPHOFF, 2002; CAPES-DAVIS et al., 2010; YOUNG; SUNG; MASTERS, 2010).

 Por isso, antes de iniciar qualquer estudo é importante buscar maiores informações sobre as células que serão utilizadas em sites especializados como do Comitê Internacional de Autenticação de Linhagens Celulares – ICLAC e The Cellosaurus, entre outros (BAIROCH, 2018). Além disso, as linhagens celulares devem ser adquiridas, preferencialmente, de bancos de células reconhecidos, que possuem um controle de qualidade rigoroso (CAPES-DAVIS et al., 2010; GERAGHTY et al., 2014; MARX, 2014).

Para reduzir essa problemática, Nardone (2007) também sugere que as revistas e instituições de fomento à pesquisa exijam a comprovação da autenticação das linhagens para publicação de resultados e liberação de recursos financeiros, o que vem sendo adotado por algumas organizações, entre outras ações.

Este trabalho tem como objetivos abordar a importância da autenticação de linhagens celulares, discorrer sobre as principais técnicas disponíveis, assim como suas vantagens e limitações, o que colabora com a conscientização da comunidade científica sobre a necessidade de utilizar células obtidas de coleções reconhecidas e necessidade do constante monitoramento das mesmas.

METODOLOGIA

Esta revisão de literatura aborda o tema de autenticação celular e as principais técnicas recomendadas. Sendo assim, foi realizada uma consulta a base de dados do PubMed (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed), utilizando os descritores: “cell culture”, “authentication”, “contamination”, “cross-contamination”, “misidentification”, “authentication techniques”; “authentication methods of cell culture”. As publicações foram avaliadas de acordo com título e resumo pertinentes ao tema e importância histórica e científica. Informações complementares foram obtidas no site do Comitê Internacional de Autenticação de Linhagens Celulares – ICLAC (https://iclac.org/).

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Existem diversas técnicas que podem ser empregadas para autenticar as linhagens celulares, tanto na comprovação da ausência de contaminação por micoplasmas, quanto na verificação da espécie de origem para garantir que as mesmas não foram contaminadas com outra linhagem celular ou erroneamente identificadas.

Para a detecção de micoplasmas pode-se utilizar ensaios de cultivo microbiológico, coloração fluorescente, imunocoloração, PCR (Polymerase Chain Reaction), microscopia eletrônica e detecção bioquímica. O cultivo microbiológico foi uma das primeiras técnicas padronizadas, muito utilizado e considerado como “padrão-ouro”. Esse método possui alta sensibilidade e especificidade, permitindo o reconhecimento visual das colônias em ágar, com aspecto típico de “ovo frito”. No entanto, o crescimento desses micro-organismos é um processo demorado (três a quatro semanas) e nem todas as espécies de micoplasmas são cultiváveis (ATCC, 1992; DREXLER; UPHOFF, 2002; PERES; CURI, 2005; YOUNG; SUNG; MASTERS, 2010; GERAGHTY et al., 2014; WRIGLEY et al., 2014).

O método de coloração fluorescente, utilizando DAPI (4′,6-Diamidine-2′-phenylindole dihydrochloride) ou Hoechst 33258 (2′-(4-hydroxyphenyl)-5-(4-methyl-1-piperazinyl)-2,5′-bi-1H-benzimidazole trihydrochloride hydrate), é uma opção barata e relativamente rápida de ser realizada. Essas substâncias coram diretamente o DNA de forma inespecífica e, ao ser visualizado em microscópio com luz ultravioleta, permite observar pontos fluorescentes sobre e ao redor dos núcleos celulares, indicando contaminação (DREXLER; UPHOFF, 2002; PERES; CURI, 2005; GERAGHTY et al., 2014; ATCC, 2022).

A técnica de PCR também pode ser empregada na detecção de micoplasmas, é rápida e com elevada sensibilidade, geralmente empregando primers (oligonucleotídeos iniciadores) universais que identificam regiões conservadas entre as diferentes espécies. Há muitos protocolos disponíveis, seja por PCR convencional ou em tempo real, além de opções de kits comerciais de diversos fornecedores (DREXLER; UPHOFF, 2002; WRIGLEY et al., 2014).

Além dessas, é possível realizar a detecção bioquímica por meio de kits comerciais, como o MycoAlert^TM, baseado na detecção de enzimas desses micro-organismos, avaliando os níveis de adenosina trifosfato (ATP) por luminescência. Embora tenha uma sensibilidade mediana, apresenta alta especificidade, permite a obtenção do resultado rapidamente, além de possuir controle positivo interno sem necessitar manipular culturas de micoplasmas (PERES; CURI, 2005; GERAGHTY et al., 2014; MAHMOOD; ALI, 2017; ATCC, 2022).

Para a confirmação da espécie de origem existem várias técnicas disponíveis, como eletroforese de isoenzimas, cariótipo, marcação imunológica, DNA fingerprint para análises das regiões de Short Tandem Repeat (STR), Variable Number of Tandem Repeat (VNTR), Single Nucleotide Polymorphism (SNP) e DNA barcode (CAPES-DAVIS et al., 2010; NIMS; REID, 2017; CAPES-DAVIS, 2018; ATCC, 2022).

Dentre essas, a eletroforese de isoenzimas é um método bioquímico que se baseia na diferença dos padrões estruturais apresentados por algumas enzimas entre as espécies, sem alterar sua função. Essas variações estruturais podem ser identificadas pela mobilidade eletroforética das isoenzimas presentes no extrato celular. A revelação do gel é feita utilizando substratos e cofatores específicos para a isoenzima desejada. Após a coloração das bandas, as distâncias de migração podem ser mensuradas e devem ser comparadas às linhagens usadas como controle e padrão do ensaio, NCTC clone 929 e HeLa, respectivamente (KAPLAN; HUKKU, 1998; NIMS et al., 1998; NIMS et al., 2010; ATCC, 2022).

Mesmo com o surgimento de metodologias baseadas em biologia molecular, a técnica de isoenzimas é de grande valia na comprovação da espécie de origem de linhagens celulares, pois a mesma é acessível, rápida, apresenta custo relativamente baixo e é capaz de detectar contaminação cruzada quando as células contaminantes correspondem a cerca de 10 % do número de células totais (NIMS et al., 1998; MACHADO et al., 2016; NIMS; REID, 2017).

Outra técnica disponível é a análise cromossômica, uma das primeiras técnicas utilizadas para identificação interespecífica, capaz de detectar rearranjos cromossômicos que são característicos de cada espécie. Para tal, devem ser analisadas ao menos 50 metáfases, o que permite a identificação do número de cromossomos, presença de possíveis marcadores, variações na ploidia e diferenciação de espécies (KAPLAN; HUKKU, 1998; CAPES-DAVIS et al., 2010). Porém, é uma metodologia trabalhosa e demorada, que necessita profissionais experientes para a correta interpretação dos resultados obtidos (KAPLAN; HUKKU, 1998; RAMYA et al., 2009; CAPES-DAVIS, 2018; ATCC, 2022).

A técnica de PCR é relativamente simples, robusta e sensível, amplamente utilizada para detecção de espécies (STACEY et al., 1997; RAMYA et al., 2009). Para a autenticação de linhagens não humanas pode ser empregada a técnica de DNA barcode, com a amplificação do gene do Citocromo C Oxidade subunidade I (COI) ou Citocromo B, ambos presentes no DNA mitocondrial (DNA Mt) e que apresentam variações entre as espécies, permitindo diferenciá-las. Ono e colaboradores (2007) utilizaram nested-PCR, com primers universais para uma região mitocondrial conservada (citocromo B, alça-D, RNAr 12S e 16S) na primeira reação e, em seguida, esse produto deve ser amplificado utilizando primers específicos para distinguir as espécies. Essa variação da PCR apresentou maior sensibilidade que a análise de isoenzimas, sendo capaz de detectar contaminações menores que 1% (ONO et al., 2007; RAMYA et al., 2009; NIMS; REID, 2017).

Para linhagens de células humanas, recomenda-se a técnica de STR fingerprint, baseado em sequências curtas de DNA, que permite a diferenciação de linhagens de indivíduos distintos. Essa técnica amplifica regiões de repetições com até cinco pares de bases dos marcadores polimórficos do genoma humano, com subsequente separação dos fragmentos em eletroforese capilar, que resulta em um padrão único. Recomenda-se analisar ao menos oito locus de STR mais amelogenina para diferenciação sexual. Os padrões obtidos consistem no número de repetições das sequências em cada alelo para os locus analisados e devem ser comparados com aqueles disponíveis em bancos de dados, como do ICLAC ou de biorrepositórios. Como variações nos padrões de STR podem ser observadas, foi estabelecido um mínimo de 80% de coincidência para que uma linhagem seja considerada autêntica; valores abaixo disso sugerem identidade suspeita ou mesmo que não corresponde à esperada, se a comparação revelar menos que 55% de compatibilidade (ICLAC, 2014). A análise de STR não permite identificar se uma linhagem humana foi contaminada por células de outra espécie animal, sendo necessário complementar a verificação com outro método.

Por conseguinte, é necessário que sejam feitos testes periódicos para garantir a autenticidade das linhagens celulares, tanto para ausência de micoplasmas quanto para confirmação da espécie de origem. Como todas as técnicas apresentam vantagens e limitações, o recomendado é empregar mais de uma metodologia para confirmar os resultados obtidos nos ensaios.

CONCLUSÕES

A autenticação das linhagens celulares é fundamental para garantir a validade dos resultados obtidos com sua utilização, evitando dois grandes problemas que afetam o uso de culturas de células, a ocorrência de contaminação cruzada e por micro-organismos, especialmente por micoplasmas. Há várias técnicas disponíveis para essas verificações e a escolha do método de autenticação, bem como a periodicidade, dependem da estrutura e condições do laboratório. Além disso, recomenda-se que seja empregada mais de uma metodologia, já que todas possuem suas vantagens e limitações. Ao assegurar a espécie de origem das células e a ausência de contaminantes, evita-se o desperdício de recursos financeiros e a perda de credibilidade, além de garantir a reprodutibilidade dos estudos com culturas celulares.

REFERÊNCIAS

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