Resumo expandido publicado nos Anais da III Mostra dos Trabalhos de Conclusão de Curso da Especialização em Vigilância Laboratorial em Saúde Pública. Para acessa-lo clique aqui.

Este trabalho foi escrito por:

Michelle de Sousa Santos¹; Christiane Asturiano Ristori²; Cecília Geraldes Martins²; Ruth Estela Gravato Rowlands²

¹Estudante do Curso de Vigilância Laboratorial em Saúde Pública – IAL Central; E-mail:  [email protected]

² Pesquisadora do Núcleo de Microbiologia do Instituto Adolfo Lutz

Resumo: Mundialmente, Salmonella é o agente etiológico mais comumente envolvido em casos e surtos de Doenças de Transmissão Hídrica e Alimentar. A doença caracteriza-se por infecção gastrointestinal, mas pode evoluir para infecção sistêmica dependendo da dose infectante, do sorotipo, dos fatores de virulência expressos e da imunidade do hospedeiro. O ciclo de infecção do patógeno envolve as etapas de adesão, invasão e multiplicação intracelular, produção de toxinas e escape dos mecanismos de defesa do hospedeiro, mediados por proteínas codificadas por genes de virulência presentes no cromossomo, em regiões denominadas ilhas de patogenicidade, e em grandes plasmídeos de virulência. O presente estudo teve como objetivo realizar a pesquisa dos genes de virulência invA, spvC, pefA, sefA, fliC em 32 cepas de Salmonella spp. provenientes de alimentos e água, e confirmar a identificação das cepas de Enteritidis pela pesquisa do gene sdfI. O gene invA foi detectado em todas as cepas de Salmonella. Com relação aos demais genes estudados, spvC e sefA foram encontrados em 12,5% das cepas e apenas em S. Enteritidis. O gene pefA foi detectado em 15,6% das cepas e o fliC em 34,4%, com maior prevalência em S. Typhimurium e sua variante monofásica S. I 4[5],12:i:-. Todas as cepas de S. Enteritidis foram positivas para o gene sdfI. Os resultados demonstram o potencial patogênico de Salmonella provenientes de produtos cárneos e água, e reforçam a importância do monitoramento e caracterização de patógenos para prevenir e diminuir os riscos à saúde do consumidor.

Palavras–chave: Água; Genes de virulência; Ilhas de patogenicidade; Produtos cárneos; Salmonella

INTRODUÇÃO

As Doenças Transmitidas por Alimentos (DTA) representam um crescente e relevante problema de saúde pública (KLINGBEIL; TOOD, 2019). De acordo com a Organização Mundial da Saúde (OMS), mundialmente, 1,9 bilhões de pessoas apresentaram doenças diarreicas, com 750,000 óbitos ao ano. Aproximadamente um terço dessas infecções é transmitido por alimentos (WHO, 2016).

Salmonella spp. é considerada um dos patógenos que mais causam surtos de DTA (CDC, 2021; EFSA, 2021). O micro-organismoé responsável por 180 milhões de doenças diarreicas que ocorrem globalmente a cada ano (WHO, 2016). Os animais representam uma importante fonte do micro-organismo, sendo, frequentemente, encontrado em produtos de origem animal como carne bovina, suína, pescados, ovos e outros produtos avícolas (QUAN et al., 2019). Nos últimos anos, houve aumento nos casos de DTA pelo patógeno envolvendo outros alimentos como vegetais e especiarias (WADAMORI et al., 2017). A ocorrência de Salmonella spp. em água e seu envolvimento em surtos de doenças de veiculação hídrica também têm sido descritos (MURPHY et al., 2017). Em humanos, as salmonelas podem causar três síndromes: febre tifoide, febre paratifoide e salmonelose (BRENNER et al., 2000). A salmonelose, doença zoonótica de grande importância em Saúde Pública (USDA, 2020), é a forma clínica mais comum e está associada ao consumo de alimentos e água contaminados (LIU et al., 2016).

Para a infecção e colonização do hospedeiro, após ingestão do micro-organismo, ocorre a invasão dos enterócitos e células M no epitélio intestinal e, ao atravessar a camada epitelial, alcançam a lâmina própria, onde são fagocitadas por macrófagos, resultando em resposta inflamatória (HANSEN-WESTER; HENSEL, 2001). O processo de invasão e colonização das células do hospedeiro é determinado pela expressão de genes, presentes em plasmídeos e/ou ilhas de patogenicidade, que codificam fatores de virulência como toxinas, fímbrias, cápsulas e flagelos (VAN ASTEN; VAN DIJK, 2005).

A adesão às células do hospedeiro é uma das primeiras etapas relacionadas à patogenicidade do micro-organismo, na qual as fímbrias exercem um papel de extrema importância (WILSON et al., 2000). O operon sef localizado em uma pequena ilha de patogenicidade é composto por quatro genes estruturais (sefABCD), necessários para translocação e biogênese das fímbrias SEF14,cuja função está relacionada com as etapas de infecção posteriores a colonização do epitélio intestinal do hospedeiro (EDWARDS; SCHIFFERLI; MALOY, 2000). A fímbria Pef é codificada pelo operon pef (pefABCD), presente em um plasmídeo de virulência, e está envolvida na adesão do epitélio intestinal e secreção de fluídos (BLAÜMLER et al., 1997).

A maioria dos genes de virulência está localizada em regiões distribuídas ao longo do cromossomo, denominadas ilhas de patogenicidades (SPI). Na SPI-1 está localizado o gene invA, fundamental para invasão dos tecidos do hospedeiro. Além dos fatores de virulência associados com as ilhas de patogenicidade de Salmonella, alguns podem ser encontrados em plasmídeos (MARCUS et al., 2000). O operon spv abriga cinco genes designados spvRABCD. A expressão dos genes spv desempenha papel na multiplicação intracelular de Salmonella, importante para disseminação e virulência do patógeno (VAN ASTEN; VAN DIJK, 2005).

Os flagelos são fatores importantes no mecanismo de virulência de muitas espécies bacterianas. Em Salmonella, duas fases antigênica são expressas, o gene fliC codifica a primeira fase, enquanto o gene fljB codifica a segunda fase (PARKHILL et a., 2001).

O gene sdf1, localizado no cromossomo, é utilizado como marcador para detecção de Salmonella Enteritidis, pois é o único sorotipo que possui esse gene (AGRON et al., 2001). Nos últimos anos, a análise de genes de virulência e seu envolvimento nos mecanismos de patogenicidade foram introduzidos como ferramenta para caracterizar isolados de Salmonella, gerando informações sobre o potencial patogênico do micro-organismo e contribuindo para ampliar os conhecimentos sobre as cepas em circulação no país e sua epidemiologia.  Assim, considerando a ampla distribuição de Salmonella e sua relevância para Saúde Pública, como um dos principais agentes patogênicos envolvidos em doenças de transmissão hídrica e alimentar no Brasil, o presente estudo teve como objetivo avaliar o perfil de virulência de cepas de Salmonella isoladas de alimentos e água.

MATERIAL E MÉTODOS

Foram avaliadas 27 cepas isoladas de produtos cárneos crus e refrigerados (coxa de frango e linguiça suína), comercializados na cidade de São Paulo e 5 provenientes de amostras de água envolvidas em surtos, analisadas pelo Núcleo de Microbiologia do Instituto Adolfo Lutz Central. A pesquisa dos genes de virulência invA, spvC e sefA foi realizada por Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) multiplex e dos genes pefA, fliC e sdflI por PCR simplex. Como controle positivo foram utilizadas as cepas de referência Salmonella Enteritidis ATCC 13076 e Salmonella Typhimurium ATCC 14028 e como controle negativo água destilada ultrapura livre de DNase/RNase. Para extração do DNA genômico, as cepas foram reativadas em caldo Brain Heart Infusion (BHI) a 35° C por 24 horas e, em seguida, semeadas em ágar BHI. Após incubação, a 35° C por 24 horas, foi realizada uma suspensão bacteriana, adicionando-se 2 a 3 colônias da cultura em 80 μL de solução fisiológica 0,85%. Após homogeneização em vórtex, a mistura foi submetida à fervura em termobloco por 15 minutos. As suspensões foram homogeneizadas e centrifugadas a 14.000 rpm por 5 min. As reações de PCR para detecção dos genes de virulência foram realizadas a partir de uma solução contendo 2 μL de DNA; 12,5 μL de GoTaq^® e 1,5 mM MgCl2 dos primers  nas concentrações de 10 pmoles e água livre de DNase/RNase  para um volume final de reação de 25 μL. As amplificações foram realizadas em termociclador. Os produtos gerados na PCR foram analisados em gel de agarose a 1,2% em tampão TBE 1x (45 mM de Tris-Borato e 1 mM de-EDTA), contendo brometo de etídio a 0,5 μg/mL. Um volume de 8 µL do produto amplificado foi aplicado no gel de agarose e submetido à eletroforese, em cuba horizontal, em tampão TBE (Apelex, França ^®) a 100 Volts por 1 h. Foi utilizado um marcador de peso molecular de 100 bp. Após a corrida, o gel foi visualizado sob transiluminação UV.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

O gene de virulência invA, responsável pela invasão das células epiteliais do hospedeiro, foi identificado em todas as cepas de Salmonella. Esses resultados corroboram com diversos estudos que detectaram o gene em 100% das cepas provenientes de fontes diversas (THUNG et al., 2018). A alta frequência observada entre os isolados sugere que o gene é conservado no gênero Salmonella, sendo comumente utilizado como marcador para detecção do patógeno (MKANGARA et al., 2020).

Os genes sefA e spvC foram identificados em 12,5% (4/32) das cepas e somente em S. Enteritidis (100%). Com relação ao sefA, o resultado era esperado, uma vez que os genes do operon sef (sefABCD) são restritos aos sorotipos do sorogrupo D (MENDONÇA et al. 2020).

O gene spvC está localizado em plasmídeos de virulência presentes em determinados sorotipos (CHU; CHIU, 2006; LIU et al., 2009). Fardsanei et al. (2017) detectaram o gene spvC em 100% das 34 cepas isoladas de produtos cárneos e ovos. Assim como o gene spvC, o pefA também está localizado em plasmídeos de virulência, sendo a sua presença limitada a determinados sorotipos (SKYBERG et al., 2006). O gene pefA foi detectado em 15,6% (5/32) das cepas, estando presente em S. Enteritidis e S. Infantis. Resultados similares foram descritos por Thung et al. (2018) que verificaram 13% das cepas, isoladas de carne bovina, positivas para o gene pefA. Os genes spvC e pefA podem estar presentes simultaneamente ou não no plasmídeo (AMMAR et al., 2016). No presente estudo, as cepas de S. Enteritidis apresentaram ambos os genes. Alguns estudos relataram sorotipos de Salmonella negativos para o pefA, apesar de possuírem plasmídeos de virulência (ELHARIRI et al., 2020).

Embora diferentes genes atuem na formação de flagelos em Salmonella, o fliC é o mais conservado e amplamente distribuído entre os sorotipos (VILELA et al., 2020). No presente estudo, o gene foi detectado em 34,4 % (11/32) das cepas, com maior ocorrência em S. Typhimurium (8/9) e sua variante monofásica (3/3). O gene também foi detectado em uma cepa de S. Infantis.

A pesquisa do gene sdfI foi realizada para confirmação molecular do sorotipo Enteritidis. A presença exclusiva deste gene em S. Enteritidis foi confirmada por Agron et al. (2001) que empregou a técnica de hibridização subtrativa supressiva para isolar fragmentos de DNA presentes nesse sorotipo e ausentes em outras bactérias.

Dentre os sorotipos descritos na subespécie enterica, S. Enteritidis e S. Typhimurium destacam-se como os mais frequentemente isolados de fontes diversas e comumente envolvidos em surtos de DTA (EFSA, 2021; FDA, 2021). A ampla distribuição de genes de virulência observada nesses sorotipos, no presente estudo e em outros reportados na literatura (THUNG et al. 2018), demonstram o potencial patogênico dos mesmos. No entanto, vale ressaltar que a patogenicidade de Salmonella é complexa e outros mecanismos de virulência estão envolvidos na expressão e codificação dos genes de virulência, além dos pesquisados no presente estudo.

CONCLUSÕES

No presente estudo, genes importantes para a virulência e patogenicidade de Salmonella foram detectados em cepas isoladas de água e produtos cárneos crus e refrigerados. Os genes de virulência invA, spvC, pefA e sefA apresentaram ampla distribuição entre as cepas de S. Enteritidis, enquanto o gene fliC foi encontrado na maioria das cepas de S. Typhimurium e S. I 4[5],12:i:-, sendo estes os sorotipos de maior relevância em surtos de DTA, mundialmente. Os resultados demonstram o potencial patogênico de Salmonella provenientes de produtos cárneos e água, e reforça a importância do monitoramento e caracterização de patógenos, causadores de doenças em humanos, para prevenir e diminuir os riscos à saúde do consumidor.

REFERÊNCIAS

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